PCR 基因扩增原理与步骤大解析

一、实验概要

PCR 扩增目标 DNA 片段。

二、实验原理

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。

1. 模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93℃ 左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2. 模板 DNA 与引物的退火（复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；

3. 引物的延伸：DNA 模板－引物结合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟， 2～3 小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。

典型的 PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl 2 、两个合成的 DNA 引物、耐热 Taq 聚合酶。

除了典型的 PCR 外，人们还根据各种用途设计了各种不同的 PCR。如：

1.RT-PCR，即在 mRNA 反转录之后进行的 PCR。

2.反向 PCR，常规 PCR 允许扩增两引物之间的 DNA 区段，而反向 PCR 则可以对靶DNA 区段之外的两侧未知的 DNA 序列进行扩增。

3.不对称 PCR，常规 PCR 使用的引物浓度相同，而不对称 PCR 使用的引物浓度不同，两种引物浓度相差 100 倍。在最初 20 各循环中，主要产物是双链 DNA。当低浓度引物被耗尽后，高浓度引物引导的 PCR 就会产生大量单链 DNA，单链 DNA 可用于序列测定。

三、主要试剂

1. DNA 模板（1ng/μL）（质粒 R-pGEX-4T-1，R 指代外源基因）

2. 2.5mmol/LdNTP (TaKaRa)

3. 10×PCR 缓冲液(TaKaRa)

4. 25mmol/L MgCl 2 (TaKaRa)

5. 引物 1、引物 2（5pmol/μL）

引物序列如下：

引物 1：5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’

引物 2：5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’

6. Taq DNA 聚合酶(TaKaRa)

7. 琼指糖

8. 溴化乙锭（1%EB，终浓度0.5μg/mL）

9. DNA marker 2000(TaKaRa)