PCR基因扩增原理及方法步骤

实验概要

PCR扩增目标DNA片段。

实验原理

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。

1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2. 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3. 引物的延伸：DNA模板－引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl 2 、两个合成的DNA引物、耐热 Taq聚合酶。

除了典型的PCR外，人们还根据各种用途设计了各种不同的PCR。如：

RT-PCR，即在mRNA反转录之后进行的PCR。

反向PCR，常规PCR允许扩增两引物之间的DNA区段，而反向PCR则可以对靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列进行扩增。

不对称PCR，常规PCR使用的引物浓度相同，而不对称PCR使用的引物浓度不同，两种引物浓度相差100倍。在最初20各循环中，主要产物是双链DNA。当低浓度引物被耗尽后，高浓度引物引导的PCR就会产生大量单链DNA，单链DNA可用于序列测定。

主要试剂

1. DNA模板（1ng/μL）（质粒R-pGEX-4T-1，R指代外源基因）

2. 2.5mmol/LdNTP (TaKaRa)

3. 10×PCR缓冲液(TaKaRa)

4. 25mmol/L MgCl 2 (TaKaRa)

5. 引物1、引物2（5pmol/μL）

引物序列如下：

引物1：5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’

引物2：5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’

6. Taq DNA聚合酶(TaKaRa)

7. 琼指糖

8. 溴化乙锭（1%EB，终浓度0.5μg/mL）

9. DNA marker 2000(TaKaRa)