【专题讨论】shRNA载体构建的oligo设计

设计原则：
1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。

3.Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。

4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。

5.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。

6.ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5"TCAAGAG3"序列最为有效。

7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录。

8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前终止。

设计原则及指导网站：
https://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rnai-sirna/general-articles/-sirna-design-guidelines.html

设计网站：
1. http://dharmacon.gelifesciences.com/design-center/?redirect=true
2. http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/sort.do
3. http://www.genelink.com/sirna/shRNAi.asp

序列比对：
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome

种子库对比

参考材料：
http://wenku.baidu.com/link?url=MWLBCFia4l5O5F271Ib0A_dQaqgCpDpkMmcbzTmHNoV5Hz60gGe7kqYYPLVIdsNdRoF7obuAfMgOkaiFtE0W9YPRphs5H_RVB6o1zX4-ULO