【交流】成功的连接实验需要优化的实验指标

进行一次成功的连接实验需要优化一系列实验指标。
A）载体和插入片段的摩尔浓度比特别重要，载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。
B）进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连接在22oC保温4-16小时，粘性末端在22oC保温3小时，或4 oC保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。每次连接反应用1-10Weiss单位的高质量连接酶。更多的资料参阅T4DNA连接酶产品插叶 #9PIM180。
C）用于转化连接反应液的细菌菌株，以及用于重组质粒扩增的菌株，需经挑选，细菌生长的温度也要挑选。
当用pGEM载体克隆大片段时（>7-8kbp），经转化的菌株在30 oC而不是在37 oC生长，更有利于连接。作简单的亚克隆连接实验，亚克隆转化效率的感受态细胞就可满足克隆需要，更高转化效率的感受态细胞可用于作比较困难的克隆实验。为提高获得目的克隆的机会，应用尽可能高转化效率的感受态细胞（>10（8次方）克隆/ugDNA）。
筛选重组克隆时，需选择抗菌素的浓度。
表1给出了常用抗菌素和常用工作浓度的范围。

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氨卞青霉素(Amp)， 工作浓度50-100ug/ml， 贮液浓度 50mg/ml(水)
氯霉素(Cm)， 工作浓度20-170 ug/ml， 贮液浓度 34mg/ml(乙醇)
卡拉霉素（Kan）， 工作浓度 30ug/ml， 贮液浓度 50mg/ml(水)
链霉素（Sm）， 工作浓度30ug/ml， 贮液浓度 50mg/ml(水)
四环素（Tet）， 工作浓度10ug/ml用于液体，12.5ug/ml用于固体， 贮液浓度12.5mg/ml(乙醇)
D）为降低背景，提高插入片段的连接效率，载体用单一限制性内切酶切割后，需去磷酸化。这可提高插入片段的连接效率，抑制载体自身连接。为使连接成功，载体和插入片段应纯化无杂质。残留的杂质会干扰连接酶的效果，抑制连接反应。Wizard PCR Prep(目录号A7170)和DNA Clean-Up(目录号A7280)可在连接前用于将载体和插入DNA的纯化。