overlap PCR时有一段序列怎么都连接不成功都有可能是什么原因？

实在不行的话，把另外两段构建好的情况下，用酶切的方法，插入第三段。

第一，你的胶放反了，第二就是在加样孔里的极有可能是蛋白或基因组，提取的时候有问题。

可能是，你的引物没设计好，重叠的部分长度不够好。过长片段的叠加通常都比较困难。PCR体系不够好，导致扩增不好。