【原创】质粒小量提取的一些经验,请大侠指正!
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我做质粒小量提取,刚开始的几次实验都没有理想的结果,分析来分析去发现问题可能是培养时间的问题:将菌种从-70度接到LB培养基37度过夜,再用此菌液涂平板获得单克隆,用EP管取1.5毫升LB培养基,用接种环每挑一个菌落每接种一管(将挑到的菌落全洗下去),37度培养约13个小时,直接按照"分子克隆"提供的碱裂法提,结果一无所获.
后来在师兄的提醒下我想到是否是因为培养时间过长而使质粒缺失?
于是我测了此菌的大致生长曲线,发现其在37度约12小时达到稳定期,于是我从培养平板上挑单克隆于100毫升LB培养12小时(37度),接着以2毫升此菌液于50毫升LB接种摇瓶,在培养时间为10,11,12小时时分别做了抽提,结果得到的条带很好.
由此我总结,在做质粒抽提时一定要首先搞清楚要抽提对象的生长周期,一般细菌在对数生长期做抽提最好.
不知道各位大侠以为?你们的一些经验可以拿来大家分享一下吗?先谢谢各位了!!!
附实验方法:
质粒DNA的小量提取 （碱法）：
一．试剂准备
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl(pH8.0) 12.5ml; 0.5M EDTA（pH 8.0）10ml; 葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在115℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ： 0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
3. 溶液Ⅲ： 醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
4. TE： 10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml
121℃,20min;4℃保存备用。
5. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：
6 .乙醇（无水乙醇或95％乙醇、70%乙醇）
7. RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热
15min，分装后贮存于-20℃。
8．含氨苄的LB液体培养基：
二．实验方案：
1.取1.5ml培养物置于一微量离心管(2ml离心管)中，在4℃下12000rpm离心2min.，弃去上清液，（将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。）使细菌沉淀尽可能干燥。
2.将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II，盖紧离心管口，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）将其快速颠倒5次（切勿振荡！！！），冰上放置5min，再加入150μl在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上3~5min.。（溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。）
3.在4℃下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一干净eppendorf管中。
4.用30－50μl含20μg/ml胰RNA酶（无DNA酶）的TE（pH8.0，含20μg /ml RnaseA）或者灭菌蒸馏水重新溶解质粒DNA，37℃水浴1h （为了将RNA彻底降解，放置一段时间是很有必要的）,置冰箱中备用。
⑥加入等体积酚∶氯仿：异戊醇（酚∶氯仿：）（1∶1），振荡混匀，在 4℃下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。
5.加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)洗一遍,同上离心.
6.加入1.5倍体积异丙醇，振荡混匀，冰上放置5min，在4℃下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。
7.用1ml70%乙醇洗涤一二次，4℃下12000g离心5-10分钟。
8.吸去上清液，室温干燥10min。
9.用15微升超纯水溶解,琼脂糖凝胶电泳检测.(上样量10微升)
后来在师兄的提醒下我想到是否是因为培养时间过长而使质粒缺失?
于是我测了此菌的大致生长曲线,发现其在37度约12小时达到稳定期,于是我从培养平板上挑单克隆于100毫升LB培养12小时(37度),接着以2毫升此菌液于50毫升LB接种摇瓶,在培养时间为10,11,12小时时分别做了抽提,结果得到的条带很好.
由此我总结,在做质粒抽提时一定要首先搞清楚要抽提对象的生长周期,一般细菌在对数生长期做抽提最好.
不知道各位大侠以为?你们的一些经验可以拿来大家分享一下吗?先谢谢各位了!!!
附实验方法:
质粒DNA的小量提取 （碱法）：
一．试剂准备
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl(pH8.0) 12.5ml; 0.5M EDTA（pH 8.0）10ml; 葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在115℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ： 0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
3. 溶液Ⅲ： 醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
4. TE： 10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml
121℃,20min;4℃保存备用。
5. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：
6 .乙醇（无水乙醇或95％乙醇、70%乙醇）
7. RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热
15min，分装后贮存于-20℃。
8．含氨苄的LB液体培养基：
二．实验方案：
1.取1.5ml培养物置于一微量离心管(2ml离心管)中，在4℃下12000rpm离心2min.，弃去上清液，（将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。）使细菌沉淀尽可能干燥。
2.将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II，盖紧离心管口，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）将其快速颠倒5次（切勿振荡！！！），冰上放置5min，再加入150μl在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上3~5min.。（溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。）
3.在4℃下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一干净eppendorf管中。
4.用30－50μl含20μg/ml胰RNA酶（无DNA酶）的TE（pH8.0，含20μg /ml RnaseA）或者灭菌蒸馏水重新溶解质粒DNA，37℃水浴1h （为了将RNA彻底降解，放置一段时间是很有必要的）,置冰箱中备用。
⑥加入等体积酚∶氯仿：异戊醇（酚∶氯仿：）（1∶1），振荡混匀，在 4℃下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。
5.加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)洗一遍,同上离心.
6.加入1.5倍体积异丙醇，振荡混匀，冰上放置5min，在4℃下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。
7.用1ml70%乙醇洗涤一二次，4℃下12000g离心5-10分钟。
8.吸去上清液，室温干燥10min。
9.用15微升超纯水溶解,琼脂糖凝胶电泳检测.(上样量10微升)
