【原创】浆核蛋白提取的一点点实验总结，请各位老师多指正！
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核蛋白提取
实验准备：
1 4℃离心机
2 根据标本数计算所需I，II，III，IV总体积，取出液体，并加入蛋白酶抑制剂，（III由加蛋白酶抑制剂I与加蛋白酶抑制剂II混合物）
实验操作：
1 收集细胞。10ml 对照细胞（1-undefined105/ml ）培养48h后，15ml 离心管收集，300g（1370 rpm）_5min。弃上清，加1ml undefinedPBS轻轻涡旋混匀后转移至1.5ml EP管。
2 4℃，300g * 5min，弃上清。
3 重悬细胞于120μl缓冲液I。
4 重悬细胞于120μl缓冲液II，4℃轻微旋转混匀，15min。
5 4℃ 2500 rpm * 1min。
6 转移上清（胞浆蛋白）至新管。
7 在沉淀中缓慢加120μl缓冲液III，轻微颠倒混匀，离心：4℃，2500 rpm * 1min。
8 弃上清，加130μl缓冲液IV（+蛋白酶抑制剂），4℃旋转混匀1h。
9 离心4℃，13000g * 10 min。
10 转移上清（核蛋白）至一新管，定量。
核提取缓冲液I（15ml）
25mM HEPES 375μl HEPES
5mM KCl 75μl 1M KCl
0.5mM MgCl2 7.5μl 1M MgCl2
DDH2O 14.54 ml
核提取缓冲液II（15ml）
25mM HEPES 375μl HEPES
5mM KCl 75μl 1M KCl
0.5mM MgCl2 7.5μl 1M MgCl2
1% NP-40 150μl NP-40
DDH2O 14.39 ml
核提取缓冲液III（15ml）
25mM HEPES 250μl HEPES
10% Sucrose 1g Sucrose
350mM NaCl 700μl 5M NaCl
0.01% NP40 1μl NP-40
DDH2O 9.1 ml
5M NaCl：14.61g/50 ml H2O
注：
1在提取浆蛋白后，吸去上清时，如第一次用100μl枪洗不干净，再离心，然后用10μl枪吸尽液体。再用III液洗一遍，如前步骤吸尽液体，再加IV液，这样的去除浆蛋白污染效果较好些。
2胞浆蛋白混胞核蛋白原因：因为药物高浓度时，胞核会破裂，所以会在高浓度处理组中胞浆蛋白混有胞核蛋白较严重；
3 胞核蛋白对照组有时会提不到原因：可能是因为没有药物处理，所以其核不容易破开。如需要，可在步骤8去掉胞浆蛋白后用枪头打匀，并振荡（我还没试过，这里只是建议）。
4我们浆蛋白内参用GAPDH或actin，没差别。核蛋白用Histone H3。
实验准备：
1 4℃离心机
2 根据标本数计算所需I，II，III，IV总体积，取出液体，并加入蛋白酶抑制剂，（III由加蛋白酶抑制剂I与加蛋白酶抑制剂II混合物）
实验操作：
1 收集细胞。10ml 对照细胞（1-undefined105/ml ）培养48h后，15ml 离心管收集，300g（1370 rpm）_5min。弃上清，加1ml undefinedPBS轻轻涡旋混匀后转移至1.5ml EP管。
2 4℃，300g * 5min，弃上清。
3 重悬细胞于120μl缓冲液I。
4 重悬细胞于120μl缓冲液II，4℃轻微旋转混匀，15min。
5 4℃ 2500 rpm * 1min。
6 转移上清（胞浆蛋白）至新管。
7 在沉淀中缓慢加120μl缓冲液III，轻微颠倒混匀，离心：4℃，2500 rpm * 1min。
8 弃上清，加130μl缓冲液IV（+蛋白酶抑制剂），4℃旋转混匀1h。
9 离心4℃，13000g * 10 min。
10 转移上清（核蛋白）至一新管，定量。
核提取缓冲液I（15ml）
25mM HEPES 375μl HEPES
5mM KCl 75μl 1M KCl
0.5mM MgCl2 7.5μl 1M MgCl2
DDH2O 14.54 ml
核提取缓冲液II（15ml）
25mM HEPES 375μl HEPES
5mM KCl 75μl 1M KCl
0.5mM MgCl2 7.5μl 1M MgCl2
1% NP-40 150μl NP-40
DDH2O 14.39 ml
核提取缓冲液III（15ml）
25mM HEPES 250μl HEPES
10% Sucrose 1g Sucrose
350mM NaCl 700μl 5M NaCl
0.01% NP40 1μl NP-40
DDH2O 9.1 ml
5M NaCl：14.61g/50 ml H2O
注：
1在提取浆蛋白后，吸去上清时，如第一次用100μl枪洗不干净，再离心，然后用10μl枪吸尽液体。再用III液洗一遍，如前步骤吸尽液体，再加IV液，这样的去除浆蛋白污染效果较好些。
2胞浆蛋白混胞核蛋白原因：因为药物高浓度时，胞核会破裂，所以会在高浓度处理组中胞浆蛋白混有胞核蛋白较严重；
3 胞核蛋白对照组有时会提不到原因：可能是因为没有药物处理，所以其核不容易破开。如需要，可在步骤8去掉胞浆蛋白后用枪头打匀，并振荡（我还没试过，这里只是建议）。
4我们浆蛋白内参用GAPDH或actin，没差别。核蛋白用Histone H3。
