【原创】细胞RT-PCR的经验(偏向RNA提取)

做RT也做了几次,有成功也有失败,在园子中受益良多,把我自已的一个流程放上来,供大家参考.

细胞RT-PCR操作流程
实验流程
一 、取RNA：
1、 处理细胞：
（1） 贴壁细胞：先用无菌DEPC水配制的PBS洗细胞两次，弃尽PBS后，直接向培养瓶中加入1ml Trizol，通过溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。当Trizol量不足，可导致RNA中有DNA污染。
（2） 悬浮细胞：先用无菌DEPC水配制的PBS洗细胞，通过离心沉淀细胞，在Trizol中移液管反复吹打来裂解细胞，每107细胞加入1ml Trizol。
2、 冰浴5分钟，充分分解核蛋白体，加入0.2ml氯仿，剧烈颠倒混匀15秒。
3、冰浴10分钟，4℃ 12000rpm,15分钟。
4、仔细取上层水样层（体积大约为所加Trizol的60%）转入新EP管，万勿吸到蛋白。
5、加入0.5ml异丙醇,颠倒混匀后，25℃放置10分钟.
6、4℃,12000rpm,10分钟(或可见胶状片状沉淀于管底),小心移去上清.
7、75%乙醇1ml沉淀RNA(与Trizol等量),震荡混匀样品.
8、4℃,12000rpm,5分钟,尽可能彻底地吸尽上清,但要防止丢失RNA沉淀,静置以挥发乙醇.
9、DEPC水30ul 溶解RNA,并在55℃条件下孵育10分钟助溶。

二、紫外光检测：
紫外光检测260nm与280nm吸光度，计算RNA浓度与A260/280（factor:select—RNA---ref.）,比值最好大于1.65(不过我有几次小于此值也出来了,大于此值也有没批出来的时候)

三、RT-PCR(试剂盒为MBI)制备cDNA第一条链：（promega）
1、 于PCR管中加入：
总RNA 0.5-5ug(5ul)
oligo(dT)18 1ul
加水 Xul
至总体积为12ul，轻轻混匀

2、 于PCR仪上70℃ 5分钟，稍离心。

3、 5×Buffer 4ul .
RNAase 抑制剂 1ul
10mM dNTP 2ul，轻轻混匀，

4、 37℃ 5分钟，稍离心，
5、 加入M-Mulv 1ul
总体积20ul

6、 25℃ 10分钟
42℃ 60分钟
70℃ 10分钟

取出PCR管，-70℃保存，或直接应用于PCR合成

PCR的反应根据各人条件不同 ,各自设定,但我自已觉的做TOUCH DOWN比较好,而且TM变化不要超过5度.