丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

【原创】细胞RT-PCR的经验(偏向RNA提取)

丁香园论坛

4759

做RT也做了几次,有成功也有失败,在园子中受益良多,把我自已的一个流程放上来,供大家参考.

细胞RT-PCR操作流程
实验流程
一 、取RNA:
1、 处理细胞:
(1) 贴壁细胞:先用无菌DEPC水配制的PBS洗细胞两次,弃尽PBS后,直接向培养瓶中加入1ml Trizol,通过溶解细胞,通过移液管分次移出细胞裂解物。当Trizol量不足,可导致RNA中有DNA污染。
(2) 悬浮细胞:先用无菌DEPC水配制的PBS洗细胞,通过离心沉淀细胞,在Trizol中移液管反复吹打来裂解细胞,每107细胞加入1ml Trizol。
2、 冰浴5分钟,充分分解核蛋白体,加入0.2ml氯仿,剧烈颠倒混匀15秒。
3、冰浴10分钟,4℃ 12000rpm,15分钟。
4、仔细取上层水样层(体积大约为所加Trizol的60%)转入新EP管,万勿吸到蛋白。
5、加入0.5ml异丙醇,颠倒混匀后,25℃放置10分钟.
6、4℃,12000rpm,10分钟(或可见胶状片状沉淀于管底),小心移去上清.
7、75%乙醇1ml沉淀RNA(与Trizol等量),震荡混匀样品.
8、4℃,12000rpm,5分钟,尽可能彻底地吸尽上清,但要防止丢失RNA沉淀,静置以挥发乙醇.
9、DEPC水30ul 溶解RNA,并在55℃条件下孵育10分钟助溶。

二、紫外光检测:
紫外光检测260nm与280nm吸光度,计算RNA浓度与A260/280(factor:select—RNA---ref.),比值最好大于1.65(不过我有几次小于此值也出来了,大于此值也有没批出来的时候)

三、RT-PCR(试剂盒为MBI)制备cDNA第一条链:(promega)
1、 于PCR管中加入:
总RNA 0.5-5ug(5ul)
oligo(dT)18 1ul
加水 Xul
至总体积为12ul,轻轻混匀

2、 于PCR仪上70℃ 5分钟,稍离心。

3、 5×Buffer 4ul .
RNAase 抑制剂 1ul
10mM dNTP 2ul,轻轻混匀,

4、 37℃ 5分钟,稍离心,
5、 加入M-Mulv 1ul
总体积20ul

6、 25℃ 10分钟
42℃ 60分钟
70℃ 10分钟

取出PCR管,-70℃保存,或直接应用于PCR合成

PCR的反应根据各人条件不同 ,各自设定,但我自已觉的做TOUCH DOWN比较好,而且TM变化不要超过5度.

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序