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【分享】荧光定量PCR详细流程和问题解析(一)

前一段时间在百度中搜索,发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过,考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了,做的实验以及解决的问题远比五年前多了,因此利用过年的时间,写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想,无论对错,都是希望对相关的人员有些参考价值。荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了,我就不细说了,主要是写一些有人问过的事,希望写的内容是大家都关心的。 普通PCR与荧光定量P ...

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PCR 问题总结

PCR常见问题总结PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性,不出现扩增条带  PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。  模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸 ...

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【旧贴整理】花了2星期系统归纳关于PCR的各位老师旧帖,与大家分享-引物

一 设计引物应遵循以下原则:1 引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。2 引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。3 引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和 ...

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【原创】新手总结PCR/RT-PCR疑难杂症(为PCR痛苦的xdjm进来看看)

这里,很多经常遇到的问题,比如引物设计,PCR体系和条件,电泳条带分析等,我没有一一详细列举,因为这些原因比较容易找到,我这里列举的可能多是些容易忽略的疑难杂症,希望对大家有帮助。(说了是疑难杂症了,可能有一些看法走极端了,但是为了做出实验,怀疑一切,狗急跳墙,没事找抽也是值得的)。1.引物设计引物的参数合理控制,像发卡结构,错配,二聚体等,只要别太过分,问题应该不大,当然没有最好,个人感觉上下游两条引物的退火温度这个参 ...

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PCR 的优化

PCR的优化在PCR的优化开始阶段,应用新的DNA模板,引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法,其扩增效果一般总不是最佳的。这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和(或)增加目的DNA产物的产率。表1列举了一些通常遇到的问题和对PCR反应进行优化的一些推荐方法。表1 PCR扩增的疑难解析问题解释补救措施目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈不清晰的成片 ...

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【原创】多重PCR引物设计 (1) ——模板序列预处理

文 / 屈武斌 (quwubin@gmail.com)多重PCR引物设计,一个重要的方面在模板序列的预处理,处理好了后面的引物设计将事半功倍。问题:假设我们要对6个模板(基因)序列设计6对引物,每对引物特异性的扩增特定的模板序列。针对这一问题,首先我们要设计6对引物,这6对引物要在一个体系中反应,因此彼此之间不能产生二聚体,最好它们的最佳退火温度相同,不能发生非特异扩增。要实现上面的目标,比较复杂,这里先从最基础的来说,即模板序 ...

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【分享】PCR资源

以下是在我查的因物设计要注意的一些问题,和大家共享PCR引物设计的黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为 ...

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【分享】如何建立一个PCR实验室

如何建立一个PCR实验室?为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出.1、样品准备区这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施:1)PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。2)组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。3)用于样品处理的工具不能被用作普通 ...

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【心得】RT PCR的△△ct法的原理和一个简单的excel处理表

数据分析excel地址http://d.dxy.cn/detail/4503890△△Ct法的推导过程PCR指数扩增公式是:Xn = X0 * ( 1 + Ex )n 式中,Xn是第 n 个循环后目标分子数,Xo 是初始目标分子数,Ex是目标分子扩增效率,n 是循环数。用Ct 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数,因此:Xt = X0 * ( 1 + Ex )Ctx 式中,Xt 是目标分子X达到设定的阈值时的分子数,是一个常数。Ctx 是目标分子X扩增达到阈值时(即达到规定的拷贝数时)的循环数。对于看家基因的P ...

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PCR问题的总结,希望给你一些帮助

pcr产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性,不出现扩增条带  pcr反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性 ④pcr循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。  模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引 ...

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【原创】LAMP实验降低污染方法心得

做LAMP实验有一年多的时间了,其间共做了3个关于LAMP的课题,目前为止基本没有污染~尤其是自己的毕业论文,用完了500uL的 FIP,全部开盖跑电涌,没有一次污染。今天为止做完了所有毕业实验,坐下来总结一下自己的心得~~我只是个小硕士生~~所以都是在浅显的方面叙述,希望大家不要鄙视~~首先感谢一下LAMP交流群,没有这么多老师和同伴在,我不可能顺利毕业。。比较可惜的是群里现在人满了。。下面开始正文~~1. 引物我一共用过8组 ...

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PCR产物纯化之试剂盒回收法

PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP,这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程,因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多,商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。PCR产物纯化回收试剂盒(SunShinecleanTM PCR Product Recovery kit)可简单、快速、有效的从PCR反应或其它各种酶促反应液中纯化Dundefined*段。根据回收片段大小不同,最高回收率 ...

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【原创】PCR常见问题总结

PCR产物的电泳检测时间  一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性,不出现扩增条带  PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。  模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时 ...

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--PCR/RT-PCR疑难问题解答--

--PCR/RT-PCR疑难问题解答1.问题:RT-PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因:1)RNA被降解建议解决方法:在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA;在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加 ...

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【分享】著名生物技术公司特色简介

一、分子生物学Promega:Promega公司是分子生物学研究工具的经典品牌,已有接近30年的历史,是生命科学这个朝阳产业中的“老字号”。该公司所特有的萤光素酶生物发光技术,灵敏度高,信号/背景比率低,在基础研究和药物筛选领域内得到广泛的应用和认可。应用范围涉及报告基因检测;细胞学活力、细胞毒作用、细胞凋亡检测;蛋白酶、蛋白激酶、核受体检测,以及描述药物先导物的吸收、分布、代谢、排泄等特征性参数的一系列检测方法。Pr ...

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help:请各位高手帮忙看看我设计的SD大鼠caspase-3的引物

我最近用一在线的引物设计软件设计了一对SD大鼠caspase-3 的引物,不知行不,请高手多多帮忙.结果如下:Primer3 Output--------------------------------------------------------------------------------WARNING: Numbers in input sequence were deleted.No mispriming library specifiedUsing 1-based sequence positionsOLIGO start len tm g ...

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我遇到的PCR问题

:(我需要扩增一段长约700bp的启动子区域,做过梯度,但每次跑出来的条带很浅,而且会随着电泳时间的增加逐渐变淡,同时,引物二聚体一直很明亮。后来做了阴性对照,竟然也出现一样的条带。我们怀疑是受了污染,但也说和引物有关。:?):?):?)所以在此求教各位帮忙提点参考意见。1 gtgcagtggc tcaatctcgg ctcactgcaa gctccgcctc ccaggttcat gccattctcc61 tgcctcagcc tacatagtag ...

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【原创】两个知名普通PCR产品比较

Applied Biosystems Veriti™ 96-Well Thermal Cycler,Veriti™ Thermal Cycler 技术特点如下:Block Format 0.2 mL AlloyFeatures Standard 0.2 mL format and sample block. Enabled to run FAST chemistry,Max Block Ramp Rate 3.9 ºC/SecMax Sample Ramp Rate 3.35 ºC/SecEnabled to run FAST Chemistry YesTemp ...

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对基因甲基化分析感兴趣的请进!

大伙好,我购买Chemicon公司的CpGenome DNA Modificatio Kit 打算五月开始做,希望以后一起交流一下甲基化分析的实验技术。QQ:395848659Here are some online resources for methylation studyCpG island prediction:CpG Island SearcherCpG PlotMethPrimerCpGProD (CpG Island Promoter Detection) newCpG ...

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求救:看一下引物设计的如何?急!

我的基因的mRNA序列如下:1 atgaatggtg acacgcgggc cgcagtggtg acctcaccac ctccaaccac agcccctcac61 aaggagaggt actttgacag agtcgatgag aacaatccag aatatttgcg ggagaggaac121 atggcaccag accttcgtca ggacttcaat atgatggagc agaagaagag ggtgtctatg181 attctgcaga gtcccgc ...

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