【分享】实时定量PCR中参照基因的选择
丁香园论坛
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过去的几年里人群中肥胖症患者的比例急剧升高。因此对脂肪细胞---脂肪组织的基本组成单位---功能的研究也不断升温。这其中大多数的研究通过从脂肪组织中提取少量的RNA来检测参与代谢调控的低丰度基因表达水平。
就小量RNA的检测而言，与传统的RNA定量检测手段（如RNA印迹分析）相比，逆转录实时定量PCR(qRT-PCR)更为灵敏。实际上，这一技术足以定量单细胞的RNA水平。qRT-PCR应用的主要限制因素是结果的高不稳定性，这源于实验所用生物系统的不同，RNA提取方式的多样化以及逆转录反应和PCR效率的差异。 所有这些变量都使得实时定量PCR结果难以进行标准化处理。
用于量化qRT-PCR结果的策略不止一种。其中的一种方法是使用标准曲线来推断靶基因的浓度。 最常用的方法是比较阈值法（comparative ΔCT method）,这种方法采用在实验条件下相对表达量不会改变的基因作为内参或参照基因（如GAPDH, b-actin）。有研究表明，如果在对qRT-PCR的数据进行标准化处理时选用的内参不当，这会导致对qRT-PCR数据的错误理解。因此，在qRT-PCR实验时选择合适的参照基因非常重要。
为验证qRT-PCR实验中参照基因的影响，美国格林斯博罗北卡来罗纳大学的弗格森（Ferguson）及其合作者选用了六个常见的参照基因使用Taqman探针进行qRT-PCR实验。他们对3T3-L1脂肪细胞进行四种不同的实验处理后对这些基因的表达变化情况进行检测，这四种实验处理分别是：炎症应激，氧化应激，同步的细胞周期和细胞分化过程。
在他们的验证实验系统中，研究者采用了特定的准则分析实验结果,即根据实验处理前后CT值的变化对参照基因进行分类：如果 ΔCT值小于等于+/- 0.5，那基因表达的波动是源于技术误差。如果 ΔCT值大于等于 +/- 1，基因表达的波动反映的是实验处理或研究条件改变引起的生物差异，这样的参照基因不适用于靶基因的标准化处理。他们通过检测参照基因随时间的表达变化情况进一步拓展这些准则。此外，实验数据全部转换成倍数变化进行分析，原始数据使用2-ΔCT法转换，标准化数据使用2-ΔΔCT 法转换。
采用以上的标准，美国研究组对上文提到的六个参照基因进行了评估。比如，当细胞处于炎症应激条件下如给予TNF-a刺激时，他们发现其中五个参照基因的相对表达量的ΔCT值小于等于+/- 0.5，因此这些参照基因可以用于靶基因的标准化。只有b-actin的ΔCT值大于等于+/- 1，在这一实验条件下不能作为内参使用。为验证结果的可信性，研究者用b-actin做内参评估TNF刺激后Dusp10的相对表达量以说明内参选择的重要性（Dusp10与脂肪细胞生物学有相关性）。选择Dusp10是因为这一基因的表达不受TNF-a刺激的影响。使用b-actin做参照基因标准化Dusp10发现Dusp10表达量在刺激前后有显著的差异，而使用其他参照基因时并未看到这种表达差异。
在其他条件处理如氧化应激处理下研究者进行了类似的分析。在氧化应激处理时，b-actin和 TfR不适合用于靶基因的标准化处理。他们进一步验证了细胞增殖和分化条件下六个参照基因的表达变化，增殖和分化通常会改变参照基因的表达水平。实际上，分化实验中有五个参照基因都不适合做内参。只有18S符合条件。后续实验研究了在脂肪细胞分化过程中扮演特定角色的靶基因的表达变化，实验结果表明选择合适的参照基因对数据的解释有极为重要的影响。
有趣的是，研究者发现在不同的实验条件下，以往的研究中认为合适的参照基因很不稳定。这些结论并不矛盾，因为参照基因的有效性局限于验证时采用的实验条件。
总之，美国研究组的结果清楚的阐明了参照基因的重要性，因为基因表达研究中得到的统计学上的显著差异很可能取决于数据标准化时选择的参照基因。因此，参照基因的有效性与实验模型有高度相关，并且是评估新的实验模型的关键因素。
就小量RNA的检测而言，与传统的RNA定量检测手段（如RNA印迹分析）相比，逆转录实时定量PCR(qRT-PCR)更为灵敏。实际上，这一技术足以定量单细胞的RNA水平。qRT-PCR应用的主要限制因素是结果的高不稳定性，这源于实验所用生物系统的不同，RNA提取方式的多样化以及逆转录反应和PCR效率的差异。 所有这些变量都使得实时定量PCR结果难以进行标准化处理。
用于量化qRT-PCR结果的策略不止一种。其中的一种方法是使用标准曲线来推断靶基因的浓度。 最常用的方法是比较阈值法（comparative ΔCT method）,这种方法采用在实验条件下相对表达量不会改变的基因作为内参或参照基因（如GAPDH, b-actin）。有研究表明，如果在对qRT-PCR的数据进行标准化处理时选用的内参不当，这会导致对qRT-PCR数据的错误理解。因此，在qRT-PCR实验时选择合适的参照基因非常重要。
为验证qRT-PCR实验中参照基因的影响，美国格林斯博罗北卡来罗纳大学的弗格森（Ferguson）及其合作者选用了六个常见的参照基因使用Taqman探针进行qRT-PCR实验。他们对3T3-L1脂肪细胞进行四种不同的实验处理后对这些基因的表达变化情况进行检测，这四种实验处理分别是：炎症应激，氧化应激，同步的细胞周期和细胞分化过程。
在他们的验证实验系统中，研究者采用了特定的准则分析实验结果,即根据实验处理前后CT值的变化对参照基因进行分类：如果 ΔCT值小于等于+/- 0.5，那基因表达的波动是源于技术误差。如果 ΔCT值大于等于 +/- 1，基因表达的波动反映的是实验处理或研究条件改变引起的生物差异，这样的参照基因不适用于靶基因的标准化处理。他们通过检测参照基因随时间的表达变化情况进一步拓展这些准则。此外，实验数据全部转换成倍数变化进行分析，原始数据使用2-ΔCT法转换，标准化数据使用2-ΔΔCT 法转换。
采用以上的标准，美国研究组对上文提到的六个参照基因进行了评估。比如，当细胞处于炎症应激条件下如给予TNF-a刺激时，他们发现其中五个参照基因的相对表达量的ΔCT值小于等于+/- 0.5，因此这些参照基因可以用于靶基因的标准化。只有b-actin的ΔCT值大于等于+/- 1，在这一实验条件下不能作为内参使用。为验证结果的可信性，研究者用b-actin做内参评估TNF刺激后Dusp10的相对表达量以说明内参选择的重要性（Dusp10与脂肪细胞生物学有相关性）。选择Dusp10是因为这一基因的表达不受TNF-a刺激的影响。使用b-actin做参照基因标准化Dusp10发现Dusp10表达量在刺激前后有显著的差异，而使用其他参照基因时并未看到这种表达差异。
在其他条件处理如氧化应激处理下研究者进行了类似的分析。在氧化应激处理时，b-actin和 TfR不适合用于靶基因的标准化处理。他们进一步验证了细胞增殖和分化条件下六个参照基因的表达变化，增殖和分化通常会改变参照基因的表达水平。实际上，分化实验中有五个参照基因都不适合做内参。只有18S符合条件。后续实验研究了在脂肪细胞分化过程中扮演特定角色的靶基因的表达变化，实验结果表明选择合适的参照基因对数据的解释有极为重要的影响。
有趣的是，研究者发现在不同的实验条件下，以往的研究中认为合适的参照基因很不稳定。这些结论并不矛盾，因为参照基因的有效性局限于验证时采用的实验条件。
总之，美国研究组的结果清楚的阐明了参照基因的重要性，因为基因表达研究中得到的统计学上的显著差异很可能取决于数据标准化时选择的参照基因。因此，参照基因的有效性与实验模型有高度相关，并且是评估新的实验模型的关键因素。
