质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核外能够进行自主复制的遗传单位，是细胞内的一种环状的小分子DNA，作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外。质粒是分子生物学实验中不可缺少的工具载体。高质量的质粒提取是下游试验顺利进行的可靠保证。质粒制备的方法主要包括以下三个步骤： 细菌的培养及扩增； 细菌的收获和裂解：一般常用碱裂解法。 质粒提取纯化。做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制 ...
Labonchip的PCR个人体会PCR应该是分子生物学的基本，记得刚进实验室时，大家的口头禅就是：今天你P了吗?那怎样才能做好PCR，结合个人体会，我谈谈自己的看法。论坛里高人很多，说得不对的还请多多指教和包含。当然，若能给新人朋友们带去一些帮助，那我本贴的目的就算是达到了。PCR设计的一般套路1） 目的基因或目的基因片段对象是什么？对于原核生物来说，由于不存在外显子和内含子，因此还比较简单，直接从genebank ...
问题1： 第1条cDNA链产物产量低或没得到可能的原因：1 RNA被降解（建议：通过变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性；2确保试剂、加样器尖头及反应管均无RNA酶。在有核酸酶抑制剂（如Promega公司的rRNasin® 核酸酶抑制剂）存在的情况下分离RNA。）2 AMV反转录酶被高温灭活（建议：如果在实验方案的开始加入了一个变性/退火步骤，则应确保在变性步骤及此后的48℃恒温之后再加入含有AMV反转录酶的酶混合物。）3 引物的特异性 ...
天津美伦医药有限公司实施GMP工作汇报各位专家、各位领导：天津美伦医药有限公司始建于1989年，隶属于天津医药集团。随着“入世”的要求和市场份额的扩大，老厂房狭小、设备陈旧、主要制药工序均委托加工，加之资金匮乏，严重制约了企业的再发展。2001年初，美伦医药有限公司进行了资产重组,筹建了新的天津美伦医药集团。在董事长赵永良先生为首的公司领导总体策划下，在天津北辰经济技术开发区购地200亩，计划投资3亿元，分三期将美 ...
Access RT-PCR系统1)什么是Access RT-PCR？2)什么是Access RT-PCR系统？3)总RNA能否作为模板，是否一定需要poly(A)+RNA?4)使用Access RT-PCR系统需要的RNA的量是多少？5)同一般常用方法相比较，Access RT-PCR系统有哪些优点？6)使用Access RT-PCR系统需要优化哪些条件？7)Tf1DNA聚合酶是否有反转录酶活力？8)为什 Access RT-PCR系统不使用MMLV反转 ...
2006.3.1~3.31 不规范帖除外，请大家规范发帖！【求助】怎样在EGFP载体前加入SP6启动子http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5634193&sty=1&tpg=40&age=0【求助】BAT40 微卫星大小http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5639177&sty=1&tpg=40&age=0【求助】POPGene分析请教http://www.dx ...
最近一直在做基因组步移，看了些资料，步骤很详细，感觉可能会大家有帮助，如果遇到细节问题还可以进一步交流，现总结如下：用于Genome Walking Kit的模板总DNA 一般要满足以下几点：1、DNA 的完整性，电泳为单一条带。2、避免杂质，OD260/280=1.8~2.0。3、模板DNA 不要被污染。4、准确定量，不要少于3μg原理基因组步行技术是一种新发展的利用已知序列(cDNA或基因组DNA)从基因组中获得基因的上游(如启动子)或下 ...
再求助内参，接上次？http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5744926&sty=1&tpg=7&age=0人口腔鳞癌Tca-8113细胞 端粒酶检测引物设计和内参引物http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5745223&sty=1&tpg=7&age=0搞不懂的PCR结果http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=57 ...
如何做标准曲线求助：EB毒理学资料求助：酵母总RNA的提取请问这样的实验如何操作？看引物设计得行不行ABI与MJ荧光定量哪个好如何知道我的引物包含有内含子序列多重PCR过程中退火温度如何掌握pcr扩增后的DNA在跑agarose胶之前还需不需要处理一下看我设计的大鼠IL－6引物行不求助RNA提取问题请大家帮忙看看我的引物PCR-ARMS是怎么个做法克隆一种野生大米谷蛋白的编码序列并测序的疑问［求助］AP ...
PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时 ...
大家好,我都快急哭了,希望各位多多关照...我刚进实验室,老板就给我一课题,就是做病毒外壳蛋白基因的原核表达,我查了大量资料,一点头绪都没有.首先我要设计引物,这是我最大的难题.因为没有人带我,只有自己摸索,万般无奈下,我只好来到丁香家园向大家求救.下面是我课题一些情况:我要作的病毒CP基因序列:ORIGIN1 atgggcacca acaagccagc cactctagct gatttgcaga aggcaattaa tggcatctc ...
目的：RT-PCR克隆全长目的基因做表达基因11: M25157. Rat Cu, Zn supero... LinksLOCUS RATSODCZL 601 bp mRNA linear ROD 27-APR-1993DEFINITION Rat Cu, Zn superoxide dismutase mRNA, complete cds.ACCESSION M25157VERSION M25157.1 GI:207011KEYWORDS superoxide dismutase.SOURCE Rattus norveg ...
1.问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因：1）RNA被降解建议解决方法：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT ...
众所周知,PCR技术以其高敏感性在分子生物学上得到了广泛应用,然而每一种方法再其优势方面的同时,其不可避免存在相关的问题,比如PCR技术的高敏感性是不是与其高特异性是一对矛盾??本人就个人研究过程中的经验总结几点所得,希望能为大家起到抛砖引玉的作用.首先,先提出影响PCR特异性的几个方面和解决方法:1. 引物序列不用多说,引物与模板的匹配是PCR成功扩增的关键,尤其上下游引物3'端的序列一定是要匹配的,但究竟要几个 ...
近来做2个基因的半定量分析，对RT的中RNA的用量问题一直没搞得很懂，也没有权威的资料可供参考，在园子里Search 了很久也没有得到理想的东西，无意中在生物谷得到了下文，虽然没有权威的出处说明，但也颇受启发，遂转来供正在做RT-PCR并和我一样处于郁闷的同仁们分享：http://www.bioon.com/experiment/pcr/pcr5/Index.htmlRT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求：1.做 ...
参考体系酶切体系（参考）：质粒 17ulbuffer 2ul酶 1ul－－－－－－－－－－37度，过夜。酶切位点在质粒上，所选的两个酶的酶切位点不可以靠的太近，如6bp建议载体质粒不要用双酶切,用两次单酶切之后切胶回收.另外建议加多以下两个个步骤:1.PCR产物的酶切片断做TA克隆,之后再酶切回收,与载体相连.2.目的片段与载体连接之后建议先转化DH5α这些容易转化的菌株. 然后筛选到的阳性克隆测序之后,提质粒,用质粒转化BL21,转化率很高 ...
PCR的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题，小编将相关内容整理出来，与大家交流讨论，希望对大家有所帮助。由于内容过多，分成了几个部分：引物设计、PCR成分、PCR反应参数、提高PCR扩增特异性、PCR污染与对策。 好东西收藏在手边，查看其它系列内容，请在GCBI微信页面输入“PCR”，即可查看下面的内容： 引物设计 PCR成分 PCR反应参数 提高PCR扩增特异性 PCR污染与对策 所谓“工欲善其事，必先利其器”，设计引物常用软件：在线P ...
问题1:不出现扩增条带引物：引物质量是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。对策为：①选定合适的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，最好用引物原液做琼脂糖凝胶电泳，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应与引物合成单位协商解决，如一条引物亮度高，一条引物亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效；④引物设计不合理，如引 ...
影响PCR结果的关键因素总结前人所说，多指教！理想的PCR反应应该是特异、高效、忠实的。研究表明PCR结果的特异、高效、忠实性都受反应中众多成分的影响，包括缓冲条件、PCR循环方式（温度和每一步的持续时间）以及DNA聚合酶等。而许多研究人员往往把PCR结果的不理想过多的归罪于引物合成的质量。其实想得到一个好的PCR结果除了要有高质量的引物外，还需要对以下每个因素的恰当控制。1，模板包括基因组DNA、质粒DNA和噬 ...
品牌不是唯一，高性价比的荧光定量PCR仪选购指南从1996年ABI公司推出了全球第一款荧光定量PCR以来，经过10几年的发展，由于荧光定量PCR仪的在科研、检测和诊断领域的广泛应用，市场规模也不断扩大。已有多家国内外生产厂商涉足研发生产,就连Eppendorf公司也于2006年底推出了自己的荧光定量PCR仪。这些产品良莠不齐，令研究人员选择是不免挑花了眼。于是很多资金充足的实验室为了保险起见都选择购买了几家 ...
