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【分享】PCR实验技术指南系列——引物设计

PCR的问题,无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题,小编将相关内容整理出来,与大家交流讨论,希望对大家有所帮助。由于内容过多,分成了几个部分:引物设计、PCR成分、PCR反应参数、提高PCR扩增特异性、PCR污染与对策。  好东西收藏在手边,查看其它系列内容,请在GCBI微信页面输入“PCR”,即可查看下面的内容:  引物设计  PCR成分  PCR反应参数  提高PCR扩增特异性  PCR污染与对策  所谓“工欲善其事,必先利其器”,设计引物常用软件:在线P ...

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【分享】PCR疑难解决

问题1:不出现扩增条带引物:引物质量是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。对策为:①选定合适的引物合成单位;②引物的浓度不仅要看OD值,最好用引物原液做琼脂糖凝胶电泳,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应与引物合成单位协商解决,如一条引物亮度高,一条引物亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度;③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效;④引物设计不合理,如引 ...

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[讨论]分子医学理论与技术讨论区——PCR专集(2)

影响PCR结果的关键因素总结前人所说,多指教!理想的PCR反应应该是特异、高效、忠实的。研究表明PCR结果的特异、高效、忠实性都受反应中众多成分的影响,包括缓冲条件、PCR循环方式(温度和每一步的持续时间)以及DNA聚合酶等。而许多研究人员往往把PCR结果的不理想过多的归罪于引物合成的质量。其实想得到一个好的PCR结果除了要有高质量的引物外,还需要对以下每个因素的恰当控制。1,模板包括基因组DNA、质粒DNA和噬 ...

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【分享】品牌不是唯一,高性价比的荧光定量PCR仪选购指南

品牌不是唯一,高性价比的荧光定量PCR仪选购指南从1996年ABI公司推出了全球第一款荧光定量PCR以来,经过10几年的发展,由于荧光定量PCR仪的在科研、检测和诊断领域的广泛应用,市场规模也不断扩大。已有多家国内外生产厂商涉足研发生产,就连Eppendorf公司也于2006年底推出了自己的荧光定量PCR仪。这些产品良莠不齐,令研究人员选择是不免挑花了眼。于是很多资金充足的实验室为了保险起见都选择购买了几家 ...

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【转贴】PCR使用技巧

增加PCR的特异性:1. primers design这是最重要的一步。理想的,只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3'端 ...

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PCR常见问题及对策

PCR常见问题及对策(一)没有得到扩增产物(1)酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。(2)模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。(3)变性温度是否准确:PCR仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。(4)反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在 ...

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RT-PCR实验方法总结大全(申请加分)

RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。要求:1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。2. RT按要求做,一般不会出太大问题。3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1)RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b ...

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【分享】invitrogen trizol 试剂盒说明书

从组织中提取总RNA1)液氮研磨,组织块直接放入研体中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol,转移入离心管进行第2步操作。2) 匀浆:组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol,另外,组织体积不能超过Trizol体积的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。从细胞中提取总RNA1) 培养贴壁细胞:不须消化 ...

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【原创】MSP的屌丝逆袭:跑不出条带的请进来

关于MSP,园子里的讨论帖子不少,但很多战友还是跑不出条带。此帖结合本人的亲身经历,就MSP提些建设性的意见,谨奉献给仍奋斗在一线的战友们。先简要的说说MSP法的原理,即用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR,然后通过电泳图检测甲基化状态。本人研究的课题是一个常见的抑癌基因,前期的研究发现此基因的表达 ...

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【分享】PCR技术的原理与方法

PCR定义PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。PCR技术的基本原理一.PCR反应成分:1.模板DNA; ...

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跪求各位高手,PCR已做了一个月但是没结果

我要得到的目的片段的序列如下:1: BD073420. Utilization of tr...OCUS BD073420 1266 bp DNA linear PAT 27-AUG-2002DEFINITION Utilization of transcription factor Brn-3a.ACCESSION BD073420VERSION BD073420.1 GI:22619023KEYWORDS JP 2001511344-A/2.SOURCE Mus musculus (house mouse) ...

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GC含量高的序列怎么拉出来

谢谢各位的解答,SORRY,这几天没上来,我的序列如下,请帮忙看一下:NM_190847. Oryza sativa (jap... LinksLOCUS NM_190847 1692 bp mRNA linear PLN 07-OCT-2003DEFINITION Oryza sativa (japonica cultivar-group) putative pectin esterase(P0415A04.26), mRNA.1 atgggtatca tccaccgagg ggacagcaca gtga ...

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【旧帖整理】PCR引物设计常用软件

献给丁香园新站友1.Primer premierPrimer premier5.0http://www.premierbiosoft.com/DATAFILES/PP500Installer.exe注册机http://www.dxy.cn/bbs/user/download/471211/primer%205.0%E6%B3%A8%E5%86%8C%E6%9C%BA.zip使用教程http://www.bio-soft.net/down/PPr ...

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【原创】real-time quantitative RT-PCR过程我这样表述可以吗?发文章用的!

RNA isolation and real-time quantitative RT-PCRTotal RNA was isolated from lung, kidney and spleen issue of Smad3-/- and WT mice with TRIzol reagent (Invitrogen, Gaithersburg, MD). For first-strand cDNA synthesis, 2.5 μg total RNA were dissolved in 25 μl DEPC-treated ddH2O. Five microliters of ...

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紧急求教各位高手:引物设计

我要作半定量RT-PCR,在文献上查引物序列用Primer分析,才50-60分,不知是直接引用文献的好,还是自己设计.下面是我从文献上查的几对引物,请帮忙看一下,可否直接引用,还是要重新设计。本人就要开始作RT-PCR了,急需您的帮助。Smad3 (308 bp, GenBank Accession No. NM_005902)5’-CAGAACGTCAACACCAAGT (nt 238–256)and 5’-ATGGAATGGCTGTAGTCGT (nt 545 ...

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[旧贴整理]二次PCR

1。二次PCR的第一次PCR产物应该稀释多少倍http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/622786_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/623784_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1025255_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/ ...

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我的PCR怎么不出结果

各位大侠:我是PCR新手,第一次作PCR,模板是含ANX A5的原核质粒。ANX A5的DNA全长如下ccatggcaca ggttctcaga ggcactgtga ctgacttccc tggatttgatgagcgggctg atgcagaaac tcttcggaag gctatgaaag gcttgggcac agatgaggagagcatcctga ctctgttgac atcccgaagt aatgctcagc gccaggaaat ctctgcagc ...

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请各位同道用blast帮我分析一下我的引物是否合适。急!!!先谢谢大家了

AIB1-U primer (5'-ATA CTT GCT GGA TGG TGG ACT-3'; sense; positions 110–130; GenBank accession no. AF012108)AIB1-L primer (5'-TCC TTG CTC TTT TAT TTG ACG-3'; antisense; positions 458–438; GenBank accession no. AF012108);如上为我的目的基因上下游引物,请各位同道帮忙用软件及blast分析一下,本人非常焦急,因试验结果很不好,正在 ...

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定点突变遇到困难

请教高手,我做一蛋白的定点突变,采用overlap的方式,但当我把短片段扩出来后,就怎么也不能将全片段(1.58Kb)扩出来,我不知道是不是引物的问题,请大家帮我看看这是整个CD序列:ATGGAACTGAAGGCCGAGGAGGAGGAGGTGGGTGGCGTCCAGCCGGTGAGCATCCAGGCCTTCGCCAGCAGCTCCACACTGCACGGCCTGGCCCACATCTTCTCCTACGAGCG ...

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PCR amplification of variable regions (SOE-Protocol)

来自该网站:http://www.archimedes.rwth-aachen.de/MolbioProtocols/Phage%20Display/PCR%20amplification%20of%20variable%20regions%20(SOE-Protocol).htmlThe SOE-Protocol given below utilises our initial set of primers for mouse and chiocken phage displ ...

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