［讨论］分子医学理论与技术讨论区——PCR专集（2)

影响PCR结果的关键因素
总结前人所说，多指教！
理想的PCR反应应该是特异、高效、忠实的。研究表明PCR结果的特异、高效、忠实性都受反应中众多成分的影响，包括缓冲条件、PCR循环方式（温度和每一步的持续时间）以及DNA聚合酶等。而许多研究人员往往把PCR结果的不理想过多的归罪于引物合成的质量。其实想得到一个好的PCR结果除了要有高质量的引物外，还需要对以下每个因素的恰当控制。

1，模板
包括基因组DNA、质粒DNA和噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA在内的DNA和RNA都是PCR反应的合适模板。一般标准的分子生物学方法制备的模板，纯度足以用于PCR，而不需要额外的纯化步骤。通常小片段的模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA，因此一般用基因组做模板时，如果没有特殊要求，可以在PCR反应前用机械剪切或稀有限制酶处理，以提高PCR产物的量。如果模板是哺乳动物基因组DNA，那么模板的量控制在0.1～1μg。而对于细菌基因组DNA或质粒DNA这些简单的基因组，每次反应所需的量仅为pg到ng级。

2．引物设计
一套理想的引物应该有效地与靶序列杂交，而与出现在模板中的其他相关序列的杂交可以忽略不计。要想得到理想的PCR结果，需要考虑引物的长度、组成和与模板结合的位置等（详见引物设计的一般思想）。而在某些特殊实验中，如等位基因特异PCR、突变工程或在基因组的特定区域引入新的限制性内切酶位点以及序列不清楚的同源基因的克隆，就需要有目的或是不可避免地引入错配碱基。

3．反应混合物
对于每一种PCR中使用的聚合酶都有其特有的标准缓冲液。尽管每个标准缓冲液适用于大多数模板和寡核苷酸引物，但对于特定的PCR的缓冲条件还是随着模板和引物以及反应液中其他成分浓度的不同而不同。因此这些所谓标准条件应被视为摸索最佳PCR条件时改进的关键。特别需要注意的是，dNTP在反应液中浓度的任何改变都会影响到有效Mg2＋的浓度，因为核苷酸可以螯合镁离子。

4．引物和dNTP的量
为使PCR效率达到最高，必须保证反应混合物中有足量的引物和dNTP。通常在100μl的反应混合物中，每一种引物的浓度在0.3μmol/L到3μmol/L之间。每种dNTP的浓度在37μmol/L到1.5mmol/L之间；需要注意的是，在扩增大片断时一般需要使用较高的dNTP浓度。引物与模板分子数的比值对PCR的特异性非常重要，如果该比值太高，则倾向于产生非特异产物，而且容易形成引物二聚体；但是如果该比值太低，PCR的效率就会大打折扣。

5．PCR循环。
典型的PCR循环由三步组成：①变性（94℃以上保温1～2分钟）；②引物退火（或杂交）（50～55℃保温1～2分钟）；③延伸（72℃保温1～2分钟）。三步循环中的每一步都有最短的有效反应时间，如果时间太长不仅浪费，而且不利于DNA聚合酶的活性。与标准PCR缓冲液一样，标准的三步PCR方式也应该是摸索最佳PCR条件时的一个关键。通常提高退火温度、降低退火和延伸时间可以提高PCR的特异性。在扩增大片断时（大于1Kb）时有必要延长每一步的时间以得到充分的扩增。