［讨论］分子医学理论与技术讨论区——PCR专集（3）

PCR常用优化策略
PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时改变已知对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。

1．降落PCR
降落PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法，它不是用许多反应管和每管用不同的试剂浓度和循环参数，而是用一个反应管或一小组反应管，在适合于扩增目的产物而不得到人为产物或引物二聚体的循环条件下反应；设计多循环反应的程序，使相连循环的退火温度越来越低、由于开始时的退火温度选择高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平。这个策略有利于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中一直处于主导地位。由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在降落PCR中必需应用热启动技术。
当引物和模板的同源性未知时，降落PCR尤其有价值，当引物是根据氨基酸序列设计的简并引物时，或者扩增多基因家族成员时，或者想进行进化PCR时经常会碰到这种情况。编设降落PCR程序的目的是要设定一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃左右。目前大多数的PCR仪上都可以很方便地进行降落PCR。

2．加入增强剂
一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲胺酰（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100μg/mL）等都可以作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。

3．Mg2＋ 浓度调整
Mg2＋浓度是一个最容易控制的参数，因为所有的浓度变化都可以在不同的反应管中同时进行。Taq DNA聚合酶的供应商现在除了提供标准缓冲液外还单独提供MgCl2溶液，以简化Mg2＋浓度的调节。一个典型的两步优化过程可以首先包括Mg2＋浓度增幅为0.5mmol/L的从0.5mmol/L到5mmol/L的一系列反应；当Mg2＋浓度范围缩小以后再做第二轮优化，采用几个增幅为0.2或0.3mmol/L的Mg2＋浓度。

4．优化退火温度；
退火温度的优化首先要采用几种方法中的一种来计算引物－模板对的Tm值，其中最简单的方法是Tm＝4（G+C）+2（A+T），一个单一碱基的错配大约降低Tm值5℃。也可以采用更加复杂的公式，但实践中由于Tm值受缓冲液中各个成分甚至引物和模板浓度的不同影响，所以任何计算的Tm值都应该看作是大致值。进行退火温度的摸索时有一定间隔（2～5℃），从高到低直到低于Tm值5℃的一系列反应可以大致估计出给定条件下的最佳退火温度。

5．循环数和再扩增；
增加循环数可以增强反应物的不足时的反应，但这样会导致产生假带以及富含单链DNA的高分子量成片产物。对于再扩增，总的原则是，如果第一次PCR反应在凝胶上见到条带，再扩增时只能用1μl第一次PCR产物的1：104到1：105稀释物。

6．热启动PCR
把PCR混合物在显著低于Tm值的温度下，哪怕是作简短的保温，也可能产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR方法则可以大大减少这些麻烦。其目标是在第一个循环中等温度升到超过反应物的Tm值以后才允许反应中的一或两种关键成分进入反应。例如在覆盖有矿物油的小实验中，所有反应管中的一种公用成分（如Taq DNA聚合酶）可以先不加，而到第一个循环的变性阶段温度超过80℃以后再加。