【分享】PCR疑难解决

问题1:不出现扩增条带
引物：引物质量是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。对策为：①选定合适的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，最好用引物原液做琼脂糖凝胶电泳，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应与引物合成单位协商解决，如一条引物亮度高，一条引物亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效；④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

问题2:出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带出现的原因：一是引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。对策为：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

问题3:出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。可能由于Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，GC含量过高引起。对策为：适当降低Mg2+浓度；增加模板量；减少循环次数；加入添加剂甘油或Qiagen公司的Q-solution。

问题4:污染的监测——对照试验
1.阳性对照：应设有阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。
2.阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照，被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照；②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。
3.重复性试验
4.选择不同区域的引物进行PCR扩增

问题5:污染的处理
（一）环境污染
1．稀酸处理法
2．紫外照射(UV)法
（二）反应液污染，可采用下列方法之一处理：
1．DNase I法
2．内切酶法
3．紫外照射法
4．Gama射线辐射法
（三）尿嘧啶糖苷酶(UNG)法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
（四）固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质。
（五）RS-PCR法(RNA-specificPCR)
也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。
（六）抗污染引物法该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点，这一区域只存在于完整的原病毒中。如果重组质粒污染了标本，就不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。