【原创】质粒制备原理及常见问题
丁香园论坛
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质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核外能够进行自主复制的遗传单位，是细胞内的一种环状的小分子DNA，作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外。质粒是分子生物学实验中不可缺少的工具载体。高质量的质粒提取是下游试验顺利进行的可靠保证。
质粒制备的方法主要包括以下三个步骤：
细菌的培养及扩增； 细菌的收获和裂解：一般常用碱裂解法。 质粒提取纯化。
做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。所以我们先介绍一下质粒制备的原理。制备质粒最常用的方式是碱裂解法。质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。
在提取质粒的过程中，质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细菌细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟练程度等等。
现在大部分质粒提取都用试剂盒， 根据实验需要我们可以选择不同级别的产品：
1. 从纯度上看：常规操作（如酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化），普通纯度的质粒即可；对于转染实验，则需要无内毒素质粒提取试剂盒。
2. 从提取量上看：1-20μg，小量提取试剂盒；20-40μg，中量提取试剂盒；大于40μg，大量提取试剂盒。
3. 宿主菌类别上：主要分为普通细菌质粒提取试剂盒，真菌质粒提取试剂盒，酵母菌质粒提取试剂盒。
举例：SunShinecleanTM无内毒素质粒小量抽提试剂盒采用新型的膜，在质粒抽提过程中，使质粒能在离心过柱的瞬间，充分结合到质粒纯化柱，并在一定条件下被充分洗脱，从而实现质粒的快速抽提纯化。同时，试剂盒中配套的内毒素清除剂可特异性溶解内毒素并与水相分离，纯化的质粒内毒素< 0.1 EU/μg。整个抽提过程迅速，无需添加RNase A，无需氯仿抽提，无需酒精沉淀，纯化后的DNA不含有RNA、蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子等杂质，质粒内毒素< 0.1 EU/μg，可立即用于酶切、PCR、DNA测序、连接、文库筛选、体外翻译、转染常规的传代细胞等下游操作。其回收率高达80%，1-5 ml菌液可回收到20 μg左右纯化质粒，纯化的质粒内毒素< 0.1 EU/ug；可抽提纯化100 bp-20 kb左右的Dundefined*段；而且无需添加RNase A，无需氯仿抽提及异丙醇沉淀，40 min内即可获得高纯度的质粒DNA。
在质粒提取过程中，未提出质粒或质粒得率低有哪些原因呢？
1）细菌老化：请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养；
2）细菌培养物生长过度或不新鲜：不要于37℃培养超过16小时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的.
3）质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体；
4）菌体中无质粒：有些菌体本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。另外检查筛选用抗生素使用浓度是否正确；
5）菌体过量，碱裂解不充分：取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的用量（应保持1：1：1.4比例）。
6）溶液使用不当 ：溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放入37℃水浴至完全溶解、澄清，方可使用；
7）质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）：洗脱溶解质粒时，可适当加温活延长溶解时间；
8）乙醇残留：洗涤液Ⅱ洗涤后应离心并静置数分钟尽量去除残留乙醇后，再加入洗脱液洗脱回收；
9）洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加入吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表面达到最大洗脱效率；
10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液用量、洗脱次数、加入洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。PH7.0－8.5之间，洗脱液用量不得小于50μl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃水浴预热可以有效提高得率30%。
实验结果发现质粒纯度不高，如何解决呢？
1）有蛋白质污染：应在加入去蛋白液后，以足够高的转速离心，使沉淀紧密，并小心地吸取上清液，避免吸入沉淀。另外，不要使用过多菌体。经悬浮液、裂解液、中和液处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。
2）有RNA 污染：说明RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入悬浮液之后，振荡充分混匀室温放置一段时间。如果悬浮液已保存6个月以上，请在悬浮液中添加RNaseA至终浓度100μg/ml。
3）混有基因组DNA：加入裂解液、中和液后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能会导致基因组DNA断裂成小碎片从而混杂在质粒中。如果加入裂解液后过于黏稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。另细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。
4）裂解液加入时间过长：裂解液加入溶液后，放置时间不宜太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。
5）含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5а和Top10.
6）质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。
如何确定质粒小抽细胞的用量
答：根据实验目的确定质粒的需求量。对于一般的克隆酶切鉴定，亚克隆、测序分析等常规分析，有几微克的DNA就够了。质粒拷贝数的高低确定接种体积的大小。高拷贝的质粒，接过2-3ml 的细胞就够了，对于中低拷贝的如pBR322,接种5ml也能满足要求。使用过过的细胞，由于细胞裂解难以彻底，时间难以把握，DNA的纯度和得率有时因吸附材料容量的限制，得率并没有显著提高，纯度反而下降。对于细胞数很大的质粒制备，需要按比例提高各溶液的用量，才能保证抽提质粒的纯度和得率。
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质粒制备的方法主要包括以下三个步骤：
细菌的培养及扩增； 细菌的收获和裂解：一般常用碱裂解法。 质粒提取纯化。做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。所以我们先介绍一下质粒制备的原理。制备质粒最常用的方式是碱裂解法。质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。
在提取质粒的过程中，质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细菌细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟练程度等等。
现在大部分质粒提取都用试剂盒， 根据实验需要我们可以选择不同级别的产品：
1. 从纯度上看：常规操作（如酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化），普通纯度的质粒即可；对于转染实验，则需要无内毒素质粒提取试剂盒。
2. 从提取量上看：1-20μg，小量提取试剂盒；20-40μg，中量提取试剂盒；大于40μg，大量提取试剂盒。
3. 宿主菌类别上：主要分为普通细菌质粒提取试剂盒，真菌质粒提取试剂盒，酵母菌质粒提取试剂盒。
举例：SunShinecleanTM无内毒素质粒小量抽提试剂盒采用新型的膜，在质粒抽提过程中，使质粒能在离心过柱的瞬间，充分结合到质粒纯化柱，并在一定条件下被充分洗脱，从而实现质粒的快速抽提纯化。同时，试剂盒中配套的内毒素清除剂可特异性溶解内毒素并与水相分离，纯化的质粒内毒素< 0.1 EU/μg。整个抽提过程迅速，无需添加RNase A，无需氯仿抽提，无需酒精沉淀，纯化后的DNA不含有RNA、蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子等杂质，质粒内毒素< 0.1 EU/μg，可立即用于酶切、PCR、DNA测序、连接、文库筛选、体外翻译、转染常规的传代细胞等下游操作。其回收率高达80%，1-5 ml菌液可回收到20 μg左右纯化质粒，纯化的质粒内毒素< 0.1 EU/ug；可抽提纯化100 bp-20 kb左右的Dundefined*段；而且无需添加RNase A，无需氯仿抽提及异丙醇沉淀，40 min内即可获得高纯度的质粒DNA。
在质粒提取过程中，未提出质粒或质粒得率低有哪些原因呢？
1）细菌老化：请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养；
2）细菌培养物生长过度或不新鲜：不要于37℃培养超过16小时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的.
3）质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体；
4）菌体中无质粒：有些菌体本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。另外检查筛选用抗生素使用浓度是否正确；
5）菌体过量，碱裂解不充分：取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的用量（应保持1：1：1.4比例）。
6）溶液使用不当 ：溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放入37℃水浴至完全溶解、澄清，方可使用；
7）质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）：洗脱溶解质粒时，可适当加温活延长溶解时间；
8）乙醇残留：洗涤液Ⅱ洗涤后应离心并静置数分钟尽量去除残留乙醇后，再加入洗脱液洗脱回收；
9）洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加入吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表面达到最大洗脱效率；
10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液用量、洗脱次数、加入洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。PH7.0－8.5之间，洗脱液用量不得小于50μl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃水浴预热可以有效提高得率30%。
实验结果发现质粒纯度不高，如何解决呢？
1）有蛋白质污染：应在加入去蛋白液后，以足够高的转速离心，使沉淀紧密，并小心地吸取上清液，避免吸入沉淀。另外，不要使用过多菌体。经悬浮液、裂解液、中和液处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。
2）有RNA 污染：说明RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入悬浮液之后，振荡充分混匀室温放置一段时间。如果悬浮液已保存6个月以上，请在悬浮液中添加RNaseA至终浓度100μg/ml。
3）混有基因组DNA：加入裂解液、中和液后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能会导致基因组DNA断裂成小碎片从而混杂在质粒中。如果加入裂解液后过于黏稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。另细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。
4）裂解液加入时间过长：裂解液加入溶液后，放置时间不宜太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。
5）含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5а和Top10.
6）质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。
如何确定质粒小抽细胞的用量
答：根据实验目的确定质粒的需求量。对于一般的克隆酶切鉴定，亚克隆、测序分析等常规分析，有几微克的DNA就够了。质粒拷贝数的高低确定接种体积的大小。高拷贝的质粒，接过2-3ml 的细胞就够了，对于中低拷贝的如pBR322,接种5ml也能满足要求。使用过过的细胞，由于细胞裂解难以彻底，时间难以把握，DNA的纯度和得率有时因吸附材料容量的限制，得率并没有显著提高，纯度反而下降。对于细胞数很大的质粒制备，需要按比例提高各溶液的用量，才能保证抽提质粒的纯度和得率。
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