【原创】FISH操作中的常见问题及对策
丁香园论坛
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FISH检测要求使用中性福尔马林（不恰当的pH值会损伤DNA）固定24-48小时。
固定时间不足会导致组织较软，在预处理过程中会丢失部分组织和信号。
固定时间过长导致组织变脆，不利于切片，也会导致大分子交联情况严重，很难进行消化。
福尔马林固定石蜡包埋的组织需要用蛋白酶进行消化以去除多余的组织来暴露细胞。
如果消化不足（酶浓度低、温度不适合、时间太短），镜下会出现云雾状组织覆盖在细胞上，无法观测到暴露独立的细胞核，从而降低杂交效率并很难选择细胞进行计数，这种情况需要重新制片。
如果消化过度，则细胞核被损伤，失去正常的圆形完整形状，变得支离破碎，甚至像鬼影一样，这种情况只能重新制片。
FISH实验中可能因为各种原因导致高背景
可能原因包括：
1、不适合的探针量
2、不适合的杂交后洗
3、样本中有过多的重复序列
解决方法包括：
1、使用合适的探针量
2、改善杂交后洗环节：
a、准备新鲜配制的洗涤液；b、检查洗涤液的pH、c、检查水浴缸的温度（71-73度，一次不超过6片洗涤，每次洗涤后重新升温）；d、洗涤时震荡洗涤缸；e、延长洗涤时间（最长5分钟）。
3、使用DNA阻断剂，如Cot-1 DNA等。
图片来自Octavian Henegariu
最常见的DNA竞争性阻断剂是COT-1 DNA，它适用于阻断人基因组中的Alu和L1家族序列，其效能是鲑精DNA的十倍。当FISH检测出现高背景，且排除预处理和杂交后洗过程中可能出现的问题时，实验者可适当加入1μg COT-1 DNA/10 μl 探针，以阻断可能引起非特异性结合的重复性序列，从而减少背景的产生。
a图使用了200微克阻断剂
j图使用了1毫克阻断剂
其它更详细的资料可以参考我的博客www.spaceyak.cn
固定时间不足会导致组织较软，在预处理过程中会丢失部分组织和信号。
固定时间过长导致组织变脆，不利于切片，也会导致大分子交联情况严重，很难进行消化。
福尔马林固定石蜡包埋的组织需要用蛋白酶进行消化以去除多余的组织来暴露细胞。
如果消化不足（酶浓度低、温度不适合、时间太短），镜下会出现云雾状组织覆盖在细胞上，无法观测到暴露独立的细胞核，从而降低杂交效率并很难选择细胞进行计数，这种情况需要重新制片。
如果消化过度，则细胞核被损伤，失去正常的圆形完整形状，变得支离破碎，甚至像鬼影一样，这种情况只能重新制片。
FISH实验中可能因为各种原因导致高背景
可能原因包括：
1、不适合的探针量
2、不适合的杂交后洗
3、样本中有过多的重复序列
解决方法包括：
1、使用合适的探针量
2、改善杂交后洗环节：
a、准备新鲜配制的洗涤液；b、检查洗涤液的pH、c、检查水浴缸的温度（71-73度，一次不超过6片洗涤，每次洗涤后重新升温）；d、洗涤时震荡洗涤缸；e、延长洗涤时间（最长5分钟）。
3、使用DNA阻断剂，如Cot-1 DNA等。
图片来自Octavian Henegariu
最常见的DNA竞争性阻断剂是COT-1 DNA，它适用于阻断人基因组中的Alu和L1家族序列，其效能是鲑精DNA的十倍。当FISH检测出现高背景，且排除预处理和杂交后洗过程中可能出现的问题时，实验者可适当加入1μg COT-1 DNA/10 μl 探针，以阻断可能引起非特异性结合的重复性序列，从而减少背景的产生。
a图使用了200微克阻断剂
j图使用了1毫克阻断剂
其它更详细的资料可以参考我的博客www.spaceyak.cn
