🔥 RNA-FISH

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术，具有快速、安全、杂交特异性高、可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

按照碱基互补配对的原则，用半抗原标记 DNA 或者 RNA 探针与经过变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。

试剂：

探针、样品、PBS、甲醛、甲酰胺

硫酸葡聚糖、无水乙醇、2×SSC、DAPI

仪器：

恒温水浴锅、培养箱、载玻片

共聚焦显微镜、盖玻片、封口膜

200 μL 移液器等

1、探针设计和合成

根据实验需求设计探针，并在 NCBI 上对设计的探针进行比对，以确定设计探针的特异性。

2、溶液配制

固定液：1×PBS + 3.7% 甲醛 

洗涤缓冲液：2×SSC + 10% 甲酰胺

杂交液：2×SSC + 100 ng/mL 硫酸葡聚糖 + 10% 甲酰胺

3、RNA FISH

（1）将一块干净的盖玻片置于 12 孔板细胞培养皿底部正中央，然后在该孔中铺上细胞进行培养。

（2）带细胞的密度达到 70% 左右时，移除培养基，用 1 mL 1×PBS 洗涤细胞两次去除死细胞，然后加入 1 mL 固定液，在室温下固定 10 min。

（3）移除固定液，用 1 mL 1×PBS 洗涤细胞两次，每次 5 min。加入 1 mL 70% 乙醇溶液覆盖细胞，放于 4 ℃ 冰箱过夜通透。

（4）移除 70% 乙醇溶液，加入 1 mL 洗涤缓冲液，将 12 孔板置于摇床上，在室温、60 rpm 条件下晃动洗涤两次，每次 5 min。

（5）取一个空的 20 μL 枪头盒，枪头架上放一张干净的封口膜，将 50 μL 加有探针（探针终浓度为 125 nM）的杂交液点在封口膜上，然后把盖玻片带有细胞的一面倒扣在杂交液上，使得有细胞的一面直接接触到杂交液。

同时在枪头盒里倒入 20 mL 2×SSC 溶液维持枪头盒中的温度，防止探针溶液挥发。将枪头盒用封口膜封上，放于 37 ℃ 培养箱中避光过夜孵育。

（6）孵育完成后，用镊子将盖玻片小心揭起，转移到装有 1 mL 洗涤缓冲液的 12 孔板中，注意让带有细胞的一面朝上，避光孵育 30 min。

（7）移除洗涤缓冲液，加入 1 mL 含 DAPI（终浓度为 5 ng/mL）的洗涤缓冲液对细胞核进行染色，避光孵育 30 min。吸去洗涤缓冲液，加入 1 mL 2×SSC 溶液，避光孵育 10 min。

（8）取一块干净的载玻片，点上少量封片液，然后用镊子轻轻夹起盖玻片，小心去除残存液体，将盖玻片带有细胞的一面倒扣在封片液上。

（9）待完成封片后，室温条件下按处理 1 h 使其自然干燥，最后在共聚焦显微镜下进行成像分析。

1. 样本准备：样本准备要充分，确保细胞数量（1000~2000 个）充足和细胞质完整性。对于固定细胞，最好使用新鲜的、高质量的细胞，并且要经过适当的处理和固定。

2. 杂交探针：选择合适的杂交探针，例如可以根据待测序列设计针对性比较强的探针。同时，还要注意探针的标记方式、浓度和杂交时间等参数。

3. 杂交条件：杂交条件需要精细控制，包括温度、盐度、pH 值等。通常情况下，杂交温度为 37 ℃，盐度为 2×SSC，pH 值为 7.2~7.5。

4. 洗涤步骤：洗涤步骤非常重要，可以有效去除非特异性结合的探针，减少背景信号。洗涤缓冲液通常包括高盐缓冲液和低盐缓冲液。

5. 显色和荧光显微镜观察：显色和共聚焦显微镜观察需要仔细进行，避免误判和偏差。在显色和共聚焦显微镜观察时，还需要注意探针的信号强度和分布情况等。

6. 实验安全：在实验过程中需要注意安全问题，例如要戴手套、护目镜等个人防护装备，避免接触有害物质。同时，还需要注意实验室的通风和废弃物处理等问题。

1. 杂交探针的信号弱：可能是因为探针的标记效率较低或探针浓度太低。可以尝试增加探针浓度或更改标记方式提高探针的信号强度。

2. 杂交背景信号干扰：可能是因为杂交条件不够理想，或者杂交时间过长。可以尝试优化杂交条件，缩短杂交时间，或者增加洗涤步骤减少背景信号。

3. 探针结合非特异性：可能是因为探针序列中有和非目标序列相似的区域，或者探针浓度过高。可以尝试选择更加特异性的探针，或者减少探针浓度来避免非特异性结合。

4. 细胞形态变形：可能是因为固定或处理方法不当，导致细胞形态变形。可以尝试改变固定或处理方法，或者使用更加适合的样本进行实验。

5. 探针信号分散不均：可能是因为探针标记不均匀或者杂交条件不够理想。可以尝试优化标记和杂交条件，或者使用更加特异性的探针来提高信号均一性。

6. 数据分析不准确：可能是因为数据分析方法不够准确或者误差较大。可以尝试使用更加准确的数据分析方法，或者增加样本数量来提高数据分析的准确性。