【心得】labonchip对PCR的一些个人体会
丁香园论坛
1923
Labonchip的PCR个人体会
PCR应该是分子生物学的基本，记得刚进实验室时，大家的口头禅就是：今天你P了吗?
那怎样才能做好PCR，结合个人体会，我谈谈自己的看法。论坛里高人很多，说得不对的还请多多指教和包含。当然，若能给新人朋友们带去一些帮助，那我本贴的目的就算是达到了。
PCR设计的一般套路
1） 目的基因或目的基因片段
对象是什么？
对于原核生物来说，由于不存在外显子和内含子，因此还比较简单，直接从genebank把序列调出来就可以，个人建议以FASTA格式（txt文本方式）保存，这可方便后面的primer或danman等软件调用。
而对于真核生物来讲，那你就要注意了。对象如果是DNA基因（即直接从基因组中调出），那你就要从genebank中调DNA序列而不是mRNA基因序列了。如果是做RT-PCR，那就要掉mRNA序列。
对于细菌来讲，由于存在种和型的分类，那这是你就要注意了，你到底是想做哪个水平的研究（是属？还是种？还是某某型），根据你的情况，调出相应基因。
2） 软件
我曾用过很多引物设计软件，从最早的primer 2.0，到oligo 6等等，还有不少在线设计软件，不过现在只用primer 5。
Primer 5界面简单（呵呵，我眼睛不好，太花销的界面我受不了），功能也强大，而且这么多年下来的经验告诉我primer 5设计出来的引物是可靠的。这说明该软件内嵌的理论、计算模型是可靠的。
Primer 5还有2大优点：1）引物设计后可以手工微调；2）能进行多重引物的设计。
当然了，引物设计后还是要上Blast上拉一下的，这是个流程。
3） 引物设计
关于引物设计的经验，有很多同学已经讲了很多，在这里我重复或补充几点：
（1）利于软件自动设计功能设计，然后根据情况手工微调（手工微调对于好的引物设计来说是很重要的，建议大家一定要掌握。
（2）2个引物的GC%和温度尽量接近。引物的长度应控制在18-24之间。
（3）dimers是影响PCR扩增效果的重要元凶，应利用手工微调的方式解决。
（4）有很多关于PCR优化的理论，我的看法是信一部分，不信一部分。我以前也很喜欢把PCR里面的很多组分来做优化分析。现在来看没多大意思。因此建议不要去动PCR体系里的什么盐离子啊、pH呀、dNTP浓度呀等等。在保证试剂质量的前提下，需要你调整的是你的退火温度。
关于退火温度，在目的带不亮且出现非特异带时，很多只习惯提高退火温度。我同意这种看法，但更建议大家在提供退火温度不解决问题时，可以尝试降低退火温度，或许能通过提供目的带的强扩增而抑制了杂带的形成。
毕竟PCR的过程就是一个竞争的过程，即是同种分子的内部竞争，也是不同分子的相互竞争。
（5）做好试剂的保存。如何保持？我的做法是母液分装成小包，每个小包能保证1周的用量，小包就放置4度冰箱。免得总是不同入冻解冻。
（6）污染是PCR过程中常出现的现象。但我认为只要你操作规范，这个问题时不大的。
（7）试验出了问题怎么处理。由于PCR过程中涉及到的因素并不多，因此很好利用排除法进行排除解决。所以有时候就要设置必要的阳性阴性以及空白对照了。
（8）不要轻易地怀疑试剂出了问题。当然在系统分析的时候可以排查这个因素。
（9）样本是PCR环节中容易出问题的。所以提醒大家在PCR出了问题时，应先想到样品是不是有问题了？
（10）PCR仪器。很多同学虽然做P不少，不过对所用的PCR仪器并不关心。目前市面上的PCR仪大部分是利用半导体加热制冷器进行的温度控制，由于半导体本身的问题有可能会导致面板本身的温度场分布不均一。因此在进行PCR时，我的建议是管子尽量放在一起。平时也留意下PCR的运作情况。
（11）多重PCR的设计无他技巧，耐心和时间问题。
（12）很多同学不喜欢对PCR进行数学计算。我的看法是先把PCR的数学模型搞清楚，再做后面的事情。
来源：http://www.biomicroarray.com/forum.php?mod=viewthread&tid=283&fromuid=86
PCR应该是分子生物学的基本，记得刚进实验室时，大家的口头禅就是：今天你P了吗?
那怎样才能做好PCR，结合个人体会，我谈谈自己的看法。论坛里高人很多，说得不对的还请多多指教和包含。当然，若能给新人朋友们带去一些帮助，那我本贴的目的就算是达到了。
PCR设计的一般套路
1） 目的基因或目的基因片段
对象是什么？
对于原核生物来说，由于不存在外显子和内含子，因此还比较简单，直接从genebank把序列调出来就可以，个人建议以FASTA格式（txt文本方式）保存，这可方便后面的primer或danman等软件调用。
而对于真核生物来讲，那你就要注意了。对象如果是DNA基因（即直接从基因组中调出），那你就要从genebank中调DNA序列而不是mRNA基因序列了。如果是做RT-PCR，那就要掉mRNA序列。
对于细菌来讲，由于存在种和型的分类，那这是你就要注意了，你到底是想做哪个水平的研究（是属？还是种？还是某某型），根据你的情况，调出相应基因。
2） 软件
我曾用过很多引物设计软件，从最早的primer 2.0，到oligo 6等等，还有不少在线设计软件，不过现在只用primer 5。
Primer 5界面简单（呵呵，我眼睛不好，太花销的界面我受不了），功能也强大，而且这么多年下来的经验告诉我primer 5设计出来的引物是可靠的。这说明该软件内嵌的理论、计算模型是可靠的。
Primer 5还有2大优点：1）引物设计后可以手工微调；2）能进行多重引物的设计。
当然了，引物设计后还是要上Blast上拉一下的，这是个流程。
3） 引物设计
关于引物设计的经验，有很多同学已经讲了很多，在这里我重复或补充几点：
（1）利于软件自动设计功能设计，然后根据情况手工微调（手工微调对于好的引物设计来说是很重要的，建议大家一定要掌握。
（2）2个引物的GC%和温度尽量接近。引物的长度应控制在18-24之间。
（3）dimers是影响PCR扩增效果的重要元凶，应利用手工微调的方式解决。
（4）有很多关于PCR优化的理论，我的看法是信一部分，不信一部分。我以前也很喜欢把PCR里面的很多组分来做优化分析。现在来看没多大意思。因此建议不要去动PCR体系里的什么盐离子啊、pH呀、dNTP浓度呀等等。在保证试剂质量的前提下，需要你调整的是你的退火温度。
关于退火温度，在目的带不亮且出现非特异带时，很多只习惯提高退火温度。我同意这种看法，但更建议大家在提供退火温度不解决问题时，可以尝试降低退火温度，或许能通过提供目的带的强扩增而抑制了杂带的形成。
毕竟PCR的过程就是一个竞争的过程，即是同种分子的内部竞争，也是不同分子的相互竞争。
（5）做好试剂的保存。如何保持？我的做法是母液分装成小包，每个小包能保证1周的用量，小包就放置4度冰箱。免得总是不同入冻解冻。
（6）污染是PCR过程中常出现的现象。但我认为只要你操作规范，这个问题时不大的。
（7）试验出了问题怎么处理。由于PCR过程中涉及到的因素并不多，因此很好利用排除法进行排除解决。所以有时候就要设置必要的阳性阴性以及空白对照了。
（8）不要轻易地怀疑试剂出了问题。当然在系统分析的时候可以排查这个因素。
（9）样本是PCR环节中容易出问题的。所以提醒大家在PCR出了问题时，应先想到样品是不是有问题了？
（10）PCR仪器。很多同学虽然做P不少，不过对所用的PCR仪器并不关心。目前市面上的PCR仪大部分是利用半导体加热制冷器进行的温度控制，由于半导体本身的问题有可能会导致面板本身的温度场分布不均一。因此在进行PCR时，我的建议是管子尽量放在一起。平时也留意下PCR的运作情况。
（11）多重PCR的设计无他技巧，耐心和时间问题。
（12）很多同学不喜欢对PCR进行数学计算。我的看法是先把PCR的数学模型搞清楚，再做后面的事情。
来源：http://www.biomicroarray.com/forum.php?mod=viewthread&tid=283&fromuid=86
