【版务】RT-PCR常见问题
丁香园论坛
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问题1： 第1条cDNA链产物产量低或没得到
可能的原因：
1 RNA被降解（建议：通过变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性；2确保试剂、加样器尖头及反应管均无RNA酶。在有核酸酶抑制剂（如Promega公司的rRNasin® 核酸酶抑制剂）存在的情况下分离RNA。）
2 AMV反转录酶被高温灭活（建议：如果在实验方案的开始加入了一个变性/退火步骤，则应确保在变性步骤及此后的48℃恒温之后再加入含有AMV反转录酶的酶混合物。）
3 引物的特异性（建议：核对“下游”引物是否与RNA下游序列相互补。）
4 引物退火（建议：如果以寡聚（dT）作为“下游”引物，则应确认在反转录反应之前，于适当的温度，如37oC，进行退火反应。）
5 RNA纯化问题（建议：一些RNA纯化过程中遗留的试剂（如SDS、NaCl、肝素、异硫氰酸胍）会干扰RT-PCR。减少目的RNA的体积，将反应物进行再纯化，或者改变纯化方法。）
问题2： 扩增产物的分子量高于预期值
可能原因：于模板RNA相关的基因组DNA污染了RNA制备物（建议：使用RQ1 无RNA酶的DNA酶消化污染的DNA。）
问题3： 扩增产物产量低或没有扩增产物
可能原因：
1 循环数不够（建议：将反应体系再进行5个循环。）
2 热循环仪程序出现错误（建议：检查设置的时间和温度是否正确。）
3 热循环仪中的一些部位温度太低（建议：设定一组阳性对照，用以确认在热循环仪的某些特定部位PCR产物的产量是否太低。）
4 反应条件不合适（建议：降低退火温度和/或针对较长的扩增产物而延长延伸时间。）
5 遗漏反应体系中的组分（建议：查对反应体系中的组分并重新进行反应。）
6 矿物油的问题（建议：反应体系必须用高质量的、无核酸酶活性的轻质矿物油覆盖。不要使用经高压灭菌处理过的矿物油。）
7 反应管未经高压灭菌处理（建议：将反应管进行高压灭菌，去除抑制扩增的污染物。）
8 第1条链产量不足（建议：参见上述“第1条链产量低或没有得到”之讨论。）
9 引物设计不当（建议：确认引物无自身互补或两条引物不互补。检查PCR引物的长度及Tm。）
现象1： 扩增产物产量低或没有扩增产物
可能原因：
1 引物的特异性错误（建议：检查所设计的引物是否与正确的链互补。）
2 反应条件不是最佳（建议：优化MgSO4浓度、退火温度及延伸时间。确认两条引物浓度相同。使用MgSO4前将其震荡混匀。）
3 核苷酸降解（建议：将核苷酸小量分装，冻存。快速融化，融化后置于冰上。避免反复冻融。）
4 目的序列不在目的RNA上（建议：重新设计实验，或尝试用其它来源的目的RNA。）
现象2： 多个，非特异性扩增产物
可能原因：
1 反应条件不是最佳（建议：优化MgSO4浓度及退火温度。使用MgSO4前将其震荡混匀。）
2 引物设计不当（建议：确认引物无自身互补，或两条引物不互补，尤其在近3'端。检查PCR引物的长度和Tm。避免在引物的3'端使用3个连续的G或C。）
3 体系被另一目的RNA/DNA污染（建议：加样时使用正排式移液管、气阻枪头以减少交叉污染。在扩增前和扩增后分别应用独立的操作区域和加样器。戴手套并经常更换。采用UNG（4）或另一种灭菌方法来防止DNA遗留到后续反应中。）
4 目的RNA中含有多个目的序列（建议：设计新引物。）
VI. 参考文献:
1. Miller, K. and Storts, D. (1995) PCR Access! A sensitive single-tube two-enzyme system for RTPCR. Promega Notes53, 2–5.
2. Kaledin, A.S., Slyusarenko, A.G. and Gorodetskii, S.I. (1981) Isolation and properties of DNA polymerase from the extreme thermophilic bacterium Thermus ruber. Biokhimiia46, 1576–84.
3. Blumberg, D.D. (1987) Creating a ribonuclease-free environment. Meth. Enzymol. 152, 20–4.
4. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. (1990) Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene93, 125–8.
5. Sellner, L.N., Coelen, R.J. and Mackenzie, J.S. (1992) Reverse transcriptase inhibits Taqpolymerase activity. Nucl. Acids Res. 20, 1487–90.
6. Chumakov, K.M. (1994) Reverse transcriptase can inhibit PCR and stimulate primer-dimer formation. PCR Meth. Appl. 4, 62–4.
7. Wizard® PCR Preps DNA Purification System Technical Bulletin#TB118, Promega Corporation.
可能的原因：
1 RNA被降解（建议：通过变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性；2确保试剂、加样器尖头及反应管均无RNA酶。在有核酸酶抑制剂（如Promega公司的rRNasin® 核酸酶抑制剂）存在的情况下分离RNA。）
2 AMV反转录酶被高温灭活（建议：如果在实验方案的开始加入了一个变性/退火步骤，则应确保在变性步骤及此后的48℃恒温之后再加入含有AMV反转录酶的酶混合物。）
3 引物的特异性（建议：核对“下游”引物是否与RNA下游序列相互补。）
4 引物退火（建议：如果以寡聚（dT）作为“下游”引物，则应确认在反转录反应之前，于适当的温度，如37oC，进行退火反应。）
5 RNA纯化问题（建议：一些RNA纯化过程中遗留的试剂（如SDS、NaCl、肝素、异硫氰酸胍）会干扰RT-PCR。减少目的RNA的体积，将反应物进行再纯化，或者改变纯化方法。）
问题2： 扩增产物的分子量高于预期值
可能原因：于模板RNA相关的基因组DNA污染了RNA制备物（建议：使用RQ1 无RNA酶的DNA酶消化污染的DNA。）
问题3： 扩增产物产量低或没有扩增产物
可能原因：
1 循环数不够（建议：将反应体系再进行5个循环。）
2 热循环仪程序出现错误（建议：检查设置的时间和温度是否正确。）
3 热循环仪中的一些部位温度太低（建议：设定一组阳性对照，用以确认在热循环仪的某些特定部位PCR产物的产量是否太低。）
4 反应条件不合适（建议：降低退火温度和/或针对较长的扩增产物而延长延伸时间。）
5 遗漏反应体系中的组分（建议：查对反应体系中的组分并重新进行反应。）
6 矿物油的问题（建议：反应体系必须用高质量的、无核酸酶活性的轻质矿物油覆盖。不要使用经高压灭菌处理过的矿物油。）
7 反应管未经高压灭菌处理（建议：将反应管进行高压灭菌，去除抑制扩增的污染物。）
8 第1条链产量不足（建议：参见上述“第1条链产量低或没有得到”之讨论。）
9 引物设计不当（建议：确认引物无自身互补或两条引物不互补。检查PCR引物的长度及Tm。）
现象1： 扩增产物产量低或没有扩增产物
可能原因：
1 引物的特异性错误（建议：检查所设计的引物是否与正确的链互补。）
2 反应条件不是最佳（建议：优化MgSO4浓度、退火温度及延伸时间。确认两条引物浓度相同。使用MgSO4前将其震荡混匀。）
3 核苷酸降解（建议：将核苷酸小量分装，冻存。快速融化，融化后置于冰上。避免反复冻融。）
4 目的序列不在目的RNA上（建议：重新设计实验，或尝试用其它来源的目的RNA。）
现象2： 多个，非特异性扩增产物
可能原因：
1 反应条件不是最佳（建议：优化MgSO4浓度及退火温度。使用MgSO4前将其震荡混匀。）
2 引物设计不当（建议：确认引物无自身互补，或两条引物不互补，尤其在近3'端。检查PCR引物的长度和Tm。避免在引物的3'端使用3个连续的G或C。）
3 体系被另一目的RNA/DNA污染（建议：加样时使用正排式移液管、气阻枪头以减少交叉污染。在扩增前和扩增后分别应用独立的操作区域和加样器。戴手套并经常更换。采用UNG（4）或另一种灭菌方法来防止DNA遗留到后续反应中。）
4 目的RNA中含有多个目的序列（建议：设计新引物。）
VI. 参考文献:
1. Miller, K. and Storts, D. (1995) PCR Access! A sensitive single-tube two-enzyme system for RTPCR. Promega Notes53, 2–5.
2. Kaledin, A.S., Slyusarenko, A.G. and Gorodetskii, S.I. (1981) Isolation and properties of DNA polymerase from the extreme thermophilic bacterium Thermus ruber. Biokhimiia46, 1576–84.
3. Blumberg, D.D. (1987) Creating a ribonuclease-free environment. Meth. Enzymol. 152, 20–4.
4. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. (1990) Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene93, 125–8.
5. Sellner, L.N., Coelen, R.J. and Mackenzie, J.S. (1992) Reverse transcriptase inhibits Taqpolymerase activity. Nucl. Acids Res. 20, 1487–90.
6. Chumakov, K.M. (1994) Reverse transcriptase can inhibit PCR and stimulate primer-dimer formation. PCR Meth. Appl. 4, 62–4.
7. Wizard® PCR Preps DNA Purification System Technical Bulletin#TB118, Promega Corporation.
