RT-PCR常见问题答疑解惑

问 题 可能原因 建议解决方法
RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
RNA被降解
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA
使用良好的无污染技术分离RNA
在将组织从动物体取出后立刻处理
在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。
RNA中包含逆转录抑制剂
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
多糖同RNA共沉淀
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。
起始RNA量不够
增加RNA量。
对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
RNA模板二级结构太多
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火
提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。
对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。
注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
引物或模板对残余的RNA模板敏感
在PCR前用RNaseH处理。
靶序列在分析的组织中不表达 尝试其他靶序列或组织
PCR没有起作用 对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物

PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
PCR引物设计较差 避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
DNA含有抑制剂 诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
富含GC的模板 对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。
模板浓度太低 使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
镁离子浓度太低 从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。
退火温度太高 使用公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。

PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
引物浓度太低 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。

RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带
引物和模板非特异性退火 在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。
GSP设计较差
RNA中沾染了基因组DNA 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
形成引物二聚体 设计在3'端没有互补序列的引物。
引物和模板非特异性退火 以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
镁离子浓度太高 对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
因为扩增复杂模板导致引物错误起始 使用巢式PCR或递减PCR。
沾染外源DNA 使用抗气雾剂的吸头和UDG
因为二级结构导致引物结合位点无法接近 对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。

PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误
聚合酶忠实性低 使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。
循环数太多 降低循环数。
四种dNTP的浓度不同 制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

定量RT-PCR无扩增产量
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照
无cDNA合成
cDNA合成温度太高 降低保温温度
反转录cDNA产物被二级结构封闭 提高保温温度。重新设计引物
RNA被损害或降解
荧光探针无功能 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。
用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。
必要的话设计和合成探针。

灵敏度低须在比预期更高的循环中检出产物

初始模板RNA不充分 增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
RNA被损害和降解
必要的话更换RNA
RNAse污染 维持无菌条件；加入RNase抑制剂
无效的cDNA
通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
无效的PCR扩增
注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺
调整cDNA合成温度或引物设计

信号高于预期在低于预期的循环中即可检出产物
反应中加的样品太多 降低模板的浓度
模板或PCR残余污染 隔离污染来源，更换试剂
使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。

电泳后出现意外的条带 RNA

被基因组DNA污染 用DNase I预处理RNA
用于第一链合成的寡聚dT或随机引物 使用基因特异性引物
PCR的低特异性 优化PCR条件