Access RT-PCR系统
丁香园论坛
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Access RT-PCR系统
1)什么是Access RT-PCR?
2)什么是Access RT-PCR系统?
3)总RNA能否作为模板,是否一定需要poly(A)+RNA?
4)使用Access RT-PCR系统需要的RNA的量是多少?
5)同一般常用方法相比较,Access RT-PCR系统有哪些优点?
6)使用Access RT-PCR系统需要优化哪些条件?
7)Tf1DNA聚合酶是否有反转录酶活力?
8)为什 Access RT-PCR系统不使用MMLV反转录酶而使用AMV反转录酶?
9)在使用反转录系统时,能否用氯化镁代替硫酸镁?
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1)什么是RT-PCR?
RT-PCR是将RNA模板的反转录(RT),和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广,可用于检测产生的转录产物,分析表达的水平,不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。
2)什么是Access RT-PCR系统?
Access RT-PCR系统用于从总RNA或mRNA中, 对特异RNA模板进行反转录(RT)和聚合酶链式扩增(PCR)。这一系统在单个管子中,使用两个酶,可对极其稀少的RNA进行灵敏,快速,重复好的分析。这一系统使用禽类成髓细胞瘤病毒的反转录酶合成cDNA的第1条链,用来自黄栖热菌的热稳定 Tf1DNA聚合酶合成cDNA的第2条链,和PCR扩增DNA。
3)总RNA能否作为模板,是否一定需要poly(A)+RNA?
RNA模板可以是总RNA, mRNA[poly(A)+RNA], 或者合成的RNA转录产物。无论使用何种RNA,关键是保持在RNA提取过程中无RNA酶污染。使用Promega公司的SV总RNA提取系统(目录号Z3100和Z3101),RNAgents 总RNA提取系统(目录号Z5110)和PolyATtract-mRNA提取系统,所获得的RNA的纯度好, 适用于Access RT-PCR系统。应注意降低提取所得RNA中残留DNA的量。用Promega公司的RQ1无RNA酶的DNase(目录号M6101)处理RNA样品(随后抽提和沉淀),除去其中残留的DNA。
4)使用Access RT-PCR系统需要RNA的量是多少?
使用Access RT-PCR系统扩增RNA的低限取决于模板和引物。用正对照RNA,RNA量的低限为103个分子。总RNA模板的量在1pg-1ug的范围内,poly(A)+RNA模板的量在1-100ng的范围内, 可获的很好的结果。
5)同一般常用方法相比较,Access RT-PCR系统有什么优点?
Access RT-PCR系统在单个管子中完成反应,不需要对反应混合物作任何添加,同一般常用方法相比, 减少了操作时间,减少了污染反应混合物的机会。同单酶反应相比较,即用r TthDNA聚合酶对总RNA中的目标RNA作扩增,双酶反应更灵敏。
6)使用Access RT-PCR系统需要优化哪些条件?
有多个因素需要优化以获得最佳引物模板结合,这包括硫酸镁的浓度, 引物退火的温度,扩增的次数。
A)Access RT-PCR系统中AMV反转录酶和Tf1DNA聚合酶对镁的需要受核苷酸,引物和模板终浓度的影响。建议选择0.5-3.0mM(相差0.5mM)的硫酸镁作初步实验。
B)对于具有较高Tm的引物,增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合,因而提高特异产物的得率。
C)大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察倒。但如果目标RNA太稀少,或者只有很少的起始材料,有必要增加扩增的次数到45-50次。
7)Tf1DNA聚合酶是否有反转录酶活力?
Tf1DNA聚合酶本身在测试的条件下不具有反转录酶活力。
8)为什么Access RT-PCR系统不使用MMLV反转录酶而使用AMV反转录酶?
要使反转录有效,必须消除RNA中的多数次级结构。为次,合成cDNA的第1条链必须在较高的温度下进行。MMLV反转录酶能采用的最高温度是42oC, AMV的活力在Access RT-PCR系统中可以达到48oC。因此,使用AMV反转录酶,可以消除RNA次级结构的负面影响。
9)在使用反转录系统时,能否用氯化镁代替硫酸镁?
不能用氯化镁代替硫酸镁。Tf1DNA聚合酶在用硫酸镁和AMV/Tf15X反应液中的的活力有很大提高。
1)什么是Access RT-PCR?
2)什么是Access RT-PCR系统?
3)总RNA能否作为模板,是否一定需要poly(A)+RNA?
4)使用Access RT-PCR系统需要的RNA的量是多少?
5)同一般常用方法相比较,Access RT-PCR系统有哪些优点?
6)使用Access RT-PCR系统需要优化哪些条件?
7)Tf1DNA聚合酶是否有反转录酶活力?
8)为什 Access RT-PCR系统不使用MMLV反转录酶而使用AMV反转录酶?
9)在使用反转录系统时,能否用氯化镁代替硫酸镁?
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1)什么是RT-PCR?
RT-PCR是将RNA模板的反转录(RT),和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广,可用于检测产生的转录产物,分析表达的水平,不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。
2)什么是Access RT-PCR系统?
Access RT-PCR系统用于从总RNA或mRNA中, 对特异RNA模板进行反转录(RT)和聚合酶链式扩增(PCR)。这一系统在单个管子中,使用两个酶,可对极其稀少的RNA进行灵敏,快速,重复好的分析。这一系统使用禽类成髓细胞瘤病毒的反转录酶合成cDNA的第1条链,用来自黄栖热菌的热稳定 Tf1DNA聚合酶合成cDNA的第2条链,和PCR扩增DNA。
3)总RNA能否作为模板,是否一定需要poly(A)+RNA?
RNA模板可以是总RNA, mRNA[poly(A)+RNA], 或者合成的RNA转录产物。无论使用何种RNA,关键是保持在RNA提取过程中无RNA酶污染。使用Promega公司的SV总RNA提取系统(目录号Z3100和Z3101),RNAgents 总RNA提取系统(目录号Z5110)和PolyATtract-mRNA提取系统,所获得的RNA的纯度好, 适用于Access RT-PCR系统。应注意降低提取所得RNA中残留DNA的量。用Promega公司的RQ1无RNA酶的DNase(目录号M6101)处理RNA样品(随后抽提和沉淀),除去其中残留的DNA。
4)使用Access RT-PCR系统需要RNA的量是多少?
使用Access RT-PCR系统扩增RNA的低限取决于模板和引物。用正对照RNA,RNA量的低限为103个分子。总RNA模板的量在1pg-1ug的范围内,poly(A)+RNA模板的量在1-100ng的范围内, 可获的很好的结果。
5)同一般常用方法相比较,Access RT-PCR系统有什么优点?
Access RT-PCR系统在单个管子中完成反应,不需要对反应混合物作任何添加,同一般常用方法相比, 减少了操作时间,减少了污染反应混合物的机会。同单酶反应相比较,即用r TthDNA聚合酶对总RNA中的目标RNA作扩增,双酶反应更灵敏。
6)使用Access RT-PCR系统需要优化哪些条件?
有多个因素需要优化以获得最佳引物模板结合,这包括硫酸镁的浓度, 引物退火的温度,扩增的次数。
A)Access RT-PCR系统中AMV反转录酶和Tf1DNA聚合酶对镁的需要受核苷酸,引物和模板终浓度的影响。建议选择0.5-3.0mM(相差0.5mM)的硫酸镁作初步实验。
B)对于具有较高Tm的引物,增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合,因而提高特异产物的得率。
C)大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察倒。但如果目标RNA太稀少,或者只有很少的起始材料,有必要增加扩增的次数到45-50次。
7)Tf1DNA聚合酶是否有反转录酶活力?
Tf1DNA聚合酶本身在测试的条件下不具有反转录酶活力。
8)为什么Access RT-PCR系统不使用MMLV反转录酶而使用AMV反转录酶?
要使反转录有效,必须消除RNA中的多数次级结构。为次,合成cDNA的第1条链必须在较高的温度下进行。MMLV反转录酶能采用的最高温度是42oC, AMV的活力在Access RT-PCR系统中可以达到48oC。因此,使用AMV反转录酶,可以消除RNA次级结构的负面影响。
9)在使用反转录系统时,能否用氯化镁代替硫酸镁?
不能用氯化镁代替硫酸镁。Tf1DNA聚合酶在用硫酸镁和AMV/Tf15X反应液中的的活力有很大提高。