【旧贴整理】花了2星期系统归纳关于PCR的各位老师旧帖,与大家分享 --酶切连接

参考体系
酶切体系（参考）：
质粒 17ul
buffer 2ul
酶 1ul
－－－－－－－－－－37度，过夜。

酶切位点
在质粒上，所选的两个酶的酶切位点不可以靠的太近，如6bp
建议载体质粒不要用双酶切,用两次单酶切之后切胶回收.另外建议加多以下两个个步骤:
1.PCR产物的酶切片断做TA克隆,之后再酶切回收,与载体相连.
2.目的片段与载体连接之后建议先转化DH5α这些容易转化的菌株. 然后筛选到的阳性克隆测序之后,提质粒,用质粒转化BL21,转化率很高.质粒不一定要新鲜提取,我的质粒放在-20度冻了大半年,作为载体完全没问题,只要确定不降解.

酶切的量、小提的质粒浓度和纯度
浓度:
根据我的实验，OD值0.5左右吧，不一定很准确。260：280通常是1.8左右。3ml菌过夜，进行小提,并没有对OD限定.小提的效果好不好主要决定于你的溶液I，II,III的质量以及你的操作手法，
特别是加溶液II时最为关键。现在有很多试剂盒既便宜效果又好，条件允许的话可以考虑购买。
琼脂糖电泳目测,不一定测OD,连接比例更重要.
质粒表达载体不用测序的，通常都是跑电泳看一下质量，然后再根据图谱选择适当的酶，看能不能够切开，如果能够切开，基本上就可以采用了。
纯度:
酶切对质粒的纯度要求高，如果蛋白和RNA去的不干净会影响酶切；
我们用于酶切的质粒的ratio值一般在1.8左右。
酶量；
在量上最好不超过酶的酶切能力，一般酶都为10U/ul,就是说酶切体系里加
1ul的酶可以在合适的温度下，1小时内消化10ugDNA，但在实际操作当中
一般酶都是过量的，而且延长了酶的作用时间，比如作用6小时。
因为酶切产物用于连接，所以我们酶切时质粒的用量尽量多，用20ul的体系
时可以如下加样，我们也有用50ul的体系切过。

回收目的片段与阳标一起进行酶切:
PCR后，电泳回收目的片断（比如玻璃奶或者一次性回收柱回收），再进行酶切。除非产物非常特异，直接酶切PCR产物效果有时不是很好，还有一般PCR体系里过量得dNTPs会影响酶切效果。酶切后，可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物，获得高纯度得酶切产物，也即是你的黏性目断片断供后边得试验。而DNA的纯度对酶切效果是有很大的影响的。而酶切时应加个阳标(如含相应酶切位点的质粒载体)来确定酶和酶切体系是不是work的。如果这两步没问题，你的酶切肯定能顺利的。如果有阳标一起来切，容易找出问题的所在。

酶切不下
酶切这一步，本来问题不大，你严格按说明书上的要求进行就行了，包括酶量，酶切体系以及DNA的量也要按要求加入。而DNA的纯度和浓度是有必要测定的，最好OD260/280要接近2.0。DNA的量过大或是纯度太低都会影响酶切效果。万一如果无法充分酶切，但有所需要的片段，就可以根据markers的位置回收所需片段。
因为基因组大部分是甲基化的，酶切不下来的原因一可能是内切酶活性低，或者是基因组杂质含量较高，或者盐离子浓度太高(不同的酶有不同的盐浓度).还有就是基因组酶切酶的量要求比较多，大概1ugDNA/10u酶，如果不行还可以加大量，酶量不能超过酶切体系的1/10，浓度过高里面的甘油会影响酶的活性。接头5-端是去磷酸化的，这样就可以避免接头自连，pcr结果就会有东西出来。

连接酶反应温度
空掉开低一点,一般16度连接2-3小时;
放进4度冰箱中，连接过夜，16小时

多片段连接:
将三个片断放在一起连的,效果的确不好.还是应该一个一个地连接.

连接比例
我用T载体连接PCR产物，请问片段和载体的摩尔比怎么选择连接效率好？根据什么因素来调节？有没有经验值？
一般片段：载体＝3～8：1。根据片段的大小、连接时间、温度、感受态细胞等因素来调节。经验值就是3～8：1。4度连接过夜，用新鲜制备的感受态细胞，一般可以得到很好的克隆效率。
补充一句：如果PCR产物片段比较大(>1kb)的话一般用3：1的比例，如果比较小就几百bp的话用>3：1的比例连接效率能高一些。3-10：1一般没问题.
建议仔细参看Teasy的说明书

接头处理
接头的处理和连接这一步其实是挺头疼的。建议先制备和接头两粘端连接的线性质粒分子。因为这对于你接头是否完成了磷酸化和退火处理提供了一个评价体系。你接头处理完，并通过评价，你就可以放心用了。退火时的处理一般要使用专门的annealing buffer，否则效果不好。而对于粘端连接来说，应该问题不大，唯一担心的是能进行连接的片段太少了，影响下面的PCR扩增，所以酶切这一步是很关键的。
最后一步是高保真PCR，首先建议用Taq酶进行扩增，然后再用Pfu酶扩增，因为后者效率比较低。其实你用Taq酶如果扩出来，测序经blast/n后，如果有突变，你也完全可以根据正确的序列重新设计引物将之调出来。

注意感受态

如果还是不行，建议检查一下感受态菌的质量。
我的感觉是感受态很重要，你可以转化连接产物的同时用纯质粒转化进行感受态活性的验证，后者取1ul转化，10ul涂板，好的感受态一般要长50个菌落以上。其次是连接体系，目的片断与载体的摩尔比为3-10：1，除此，连接酶也很重要，最好不要使用储存太久的酶，建议你下次做的时候用别人的酶试一下。
转化要用空质粒作对照，保证感受态没问题，细菌一般长12到16小时就形成可见的菌落，转化后的菌落一般比为转化的菌落小一些。