请问老师，pcr序列分组的秘籍与小技巧都有哪些？可否分享一下经验？

退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩増效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩増效率。

primers design
这是zui重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些条件
1) 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的primer同样会降低特异性,并且降低产量
2) GC% 40%~60%
3) 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性
4) 避免3'端GC rich, zui后3个BASE不要有GC,或者zui后5个有3个不要是GC (有人说：3' 端zui好是 GC/CG/CC/GG。)
5) 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER
6) 避免3'端的错配
7) 避免内部形成二级结构
8) 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们
9) 使用兼并primer时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用 较高的primer浓度(1uM-3uM)
10) zui好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al.

使用兼并primer时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用 较高的primer浓度(1uM-3uM)