【旧贴整理】花了2星期系统归纳关于电泳的各位老师旧帖,与大家分享 --电泳

大片段DNA的电泳问题

一个含有8KB,16KB,20KBDNA的样品，需要跑琼脂糖电泳分离、鉴定和回收，请问：1、用0.5％的胶行不行？ 2、用什么样的MARKER，从哪里可以买到？

1）最好用低熔点的胶了，但是回收的盒子可要选好的，片断太大了，回收的效率不高，0.5%的胶很嫩的,要小心。实在不行可以用0.7%的,30伏左右低电压,最好把电泳槽放在冰箱里,低温下电泳.这种大小的ＤＮＡ根本无需０．５％的凝胶，用１％即可。DNA片段较大，最好不要采用玻璃奶或柱吸附的试剂盒回收。

2）关于marker。请到MBI的网站去看看，编号为＃SM0231的应该可以用，从48KB－8KB，具体请去MBI的网站看看就知道了，用ＬＭＰ胶，Gibco的很好，５克约３００元（Gibco)。

3）用琼脂糖酶，罗氏的非常好。TAE电泳完后EB染色，切下亮带，尽可能去掉不含DNA的凝胶以缩小体积，用双蒸水漂洗数次，７０度加热熔化，冷至４５度，注意不要加入酶BUFFER，加入酶保温１小时，凝胶会液化，此DNA溶液可直接作任何分子生物学实验。
先用普通胶电泳，染色后在所需带前方挖一方槽，灌注LMP胶再电泳，让所需带进入LMP，再回收。每次花费实际很少。

带弱或无DNA带

1) DNA的上样量不够 增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低

2) DNA降解 避免DNA的核酸酶污染

4) DNA 变性 电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA

5) DNA走出凝胶 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度

6) 对于EB染色的DNA，所用光源不合适 应用短波长（254nm）的紫外光源

7} 分子大小相近的DNA带不易分辨 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度

8) DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析

9）marker量可以减半来使用，其实点样不一定是6微升，算着比较方便而已，实际根据你的需要、DNA的浓度和胶的情况来看。
一管新的Marker必须分装，保存在-20度，取一管放在4度冰箱供使用。隔一段时间不用的话,最好离心一下,免得沉淀

10）蛋白污染是不是很严重？

11）在加EB的时候，胶是不是温度太高？需要等到胶冷到70~80度左右再加EB，否则容易降解。理论上，用Ethidium bromide染色，UV下可以检出1-10ng的DNA条带。如果你酶切前的1ul德DNA产物跑电泳比较亮的话，酶切体积一般是20ul，你取10ul跑电泳，一般都可以看得见得。

不规则DNA带迁移

1) 对于λ/Hind III片段cos位点复性 电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟

2) 电泳条件不合适 电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液

3) DNA变性 以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热

DNA凝胶电泳条带会斜掉

一般条带斜有以下几个原因：

1.电泳槽老化 左右两边电压不同， 导致整个胶面带斜了

2.电压太高，导致温度变化

3.胶不匀，配得不好

4.胶放斜了

5.电泳液高出胶面很多,也会跑斜,液面最好刚高过胶即可.

DNA电泳带糊

DNA带模糊

1) DNA降解 避免核酸酶污

2) 电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液

3) 所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力

4) DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量

5) DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐

6) 有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白

7) DNA变性 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA

琼脂糖电泳的DNA加量及容积的问题。

1、分子生物学技术一书中说，5mm的加样孔最小可以看到2ng的DNA，最大不要超过500ng。而且一个标准的加样孔最多可以加30-40ul

2、一般的原则：0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。

3、一般是加5－20ul（0.7cm宽加样孔）。DNA加量及容积是很灵活的，根据具体的DNA样品浓度来决定。

当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带（见分子克隆第三版）。所以当你的样品浓度较大时，就可以适当少加，如1－10ul。如果你的样品浓度很小，你可以加样品的体积稍大一些，如10－20ul。加10倍的上样缓冲液，使其终浓度为1倍即可。

提质粒后，电泳点样时，质粒DNA浮起来了

1）浓度较大出现漂浮现象. 点样时要慢, 点完后放置一段时间,待样品沉淀至底部后,再开始电泳.

2）你可以用甘油作为载样缓冲液，3ul甘油+5ul质粒，

3）《分子克隆》上说：发生这种现象的原因是乙醇没有除净！

可能是有机溶剂没有除净,我也出现过这样的情况,用70%的酒精洗几

4）以前电泳时也出现过这种情况，其中可能原因有可能是提取过程中SDS未除干净，上样时会造成此现象。
我认为解决的办法有2个：样品提纯后再电泳；上样时减少缓冲液的量，让缓冲液液面刚到胶面以上即可，当样品跑出加样孔后再添缓冲液继续电泳。

DNA电泳有的人为什么加水？

加水是为了上样到加样孔里后使样品均匀,跑出来的条带更好.因为电泳液在电泳一段时间后水分会蒸发，从而导致电泳液的离子强度增大，影响了电泳液的缓冲能力，因此适当的加一些双蒸水以弥补损失的水分。 电泳有时候只是为了标定浓度的。

2、在高浓度的胶上我的电泳图像呈弧形，有的还有锯齿状的条带。这是什么原因呢？

胶没灌好,导致胶孔不整齐或裂缝.解决方法很简单,拔梳子之前用一个塑料吸管吸取一些电泳槽的缓冲液,沿梳子的两侧冲一冲,缓冲液再流回电泳槽,然后拔梳子,这时候的胶孔真的是整整齐齐.

基因组DNA电泳出现很宽连在一起的条带，原因？测基因组DNA电泳浓度，两个DNA样本分别稀释了3个不同浓度，与原样本一共8份样，浓度最大的是50ng/ul，最小的是0.5ng/ul，加样5ul。设定80V,250mA,40min，电泳开始后电泳槽表面从两极开始出现很多小气泡，呈白色泡沫状，电泳结束时我的胶几乎都被泡沫给覆盖了。在紫外灯下看到的是一片很宽的带，所有的泳道荧光都混在了一起。理论上这些样本应该荧光强度不一，但结果却全部混在了一起。

1），你1个月前抽提的DNA，反复冻融5－6次对DNA影响不大

2），你的胶块中可能有杂质或气泡导致带型不整齐

3），TAE电泳缓冲液的缓冲能力有限，电泳槽两端PH发生剧烈变化，很可能是导致 这样结果的主要原因。

4），电流250mA 太高了,80V40mA左右

建议：

1）、充分融胶，倒胶时避免气泡产生及杂质污染，

2）、调低电流和电压，

3）、电泳槽中用新鲜的TAE或TBE缓冲液（用TAE时要特别注意）。 注意TAE buffer一般是配成50X的保存，用的时候要稀释到1X才可以倒入电泳槽

4）、此外，就算是DNA降解，也应该是单个泳道出现拖尾或地毯状。

胶的回收：

胶的上样量：似乎没有规定，一般上样>50ul，1ul预先跑一个。胶回收前精确计算你大概需要多少的样品以免浪费，而且胶回收会损失很多样品，如果样品很少直接纯化

胶回收的注意事项：

1、要作一个大孔径的胶孔，将梳子用透明胶粘起来，一次提取一批次作的PCR，避免杂带过多，所以在作胶回收之前一定有把握没有杂带，或是杂带量很小

2、认真读说明书;注意：第一次使用前先在15ml漂洗液PW中加入60ml无水乙醇，最后一步：适量的洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液现在65－70度水浴，效果更好）（13000rmp,1min），如果回收较多量的DNA，可以将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rmp,离心1mi

3、切胶回收的时候可以用个尺子，切得比较好，还不会残留太多胶在上面。

二 电泳的相关知识:

1、 胶浓度是否合适。.根据电泳的片断大小确定gel浓度
琼脂糖凝胶质量浓度% ________________ 分离大小范围(kb)
0.3 ____________________ 5-60
0.6 ____________________ 1.0-20
0.7 _____________________ 0.8-10
0.8 _____________________ 0.5-10
0.9 _____________________ 0.5-10
1.2 ____________________ 0.4-6
1.5 ______________________ 0.2-4
2.0 _____________________ 0.1-3

2、胶的制备：烧瓶配50ml的2％的琼脂糖凝胶，用高火加热大约一分钟，记住用纸口罩外面套一个塑料小口袋盖住烧瓶口防止崩溅和水份蒸发。

你可以通过微波炉半透明的玻璃门观看胶沸腾的情况，加热时间太长水分挥发过多，导致凝胶浓度变大，加热时间太短胶热不透，会产生凝胶不均匀！先用buffer溶好，晃匀，然后在微波炉中加热二十秒，然后再摇匀，加热二十秒，再摇晃，把悬浮的颗粒摇下，再加热十五秒，因为制2%的胶，上面总会有一层凝了的胶，用枪把它刮开，然后铺胶，胶要从电泳槽一面向另一面赶着倒，防止产生气泡，如果产生气泡，可以用加样枪的枪尖把气泡赶到电泳槽边上，以免影响电泳结果。

3、电泳的选择、时间：2%-2.5% 琼脂糖凝胶把双链DNA与单链DNA分开。

琼脂糖胶分辨率最高只能达到50bp,聚丙烯酰胺凝胶能分辨四个碱基的差别.如果小片段，可以适当增加胶的浓度。如：用1.5% 的胶。电泳的时间不能太久，如只有几十bp的话，电泳30－40分钟就可以。有人跑过10kb的片断，电压80，40－50min，1.25小时太长。但实际上对于多在100bp左右的酶切产物较，一开始使用琼脂糖凝胶电泳，无论如何都不能有效区分。即使使用2％琼脂糖凝胶，硬的像豆腐一样。

最后使用聚丙烯酰胺凝胶凝胶才解决了问题。

采用银染法进行聚丙烯酰胺凝胶凝胶染色，可检出低至0.5ng的DNA片段（注意硝酸银应避光保存）

4、跑胶用大电压,120V,最多三十分钟,可以跑的非常漂亮.但有人认为大电压对于跑胶好看与否关系不是很大,关键是底色要干净,胶要比较均匀较好。一般为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不得超过5V/CM。5V/CM是按什么来说的？根据槽子大小定电压

1）5V/CM 是两电极之间单位距离的电场强度（或称为电压），电压过低会导致条带扩散，条带不清晰，电压过高，致使大片断DNA带电荷多于小片断而迁移加速，结果是片断的分离效果不好，所以适中的方案是5V/CM。

2）5V/CM是分子克隆上笼统的对于大小片段都比较适合的一个值。对于小片段比如你的300bp或者更高一点，在电压增大时，不同大小的片段的迁移率将按其大小做相应比率的增加，而对于大片段比如10几Kb，在电压增加时，不同大小的片段的迁移率增加几近相同，因而会影响分离效果。

对于更大的片段比如50KB以上，即便是在5V/CM的情况下其迁移率也相差无几，那么就需要在一个不断变换方向的电场中根据不同大小的片段在电场改变时需要不同的方向转换速度，将其分离。
所以，对于你的几百bp的片段即使稳压在280v左右（我作过300v)不会对分离效果有什么太大影响，而电泳时间会大大缩短（一般十几分钟电泳就完成了）。300bp片段用1.5％的琼脂糖胶较好，电压可以是150V,时间15分钟左右。

5、PAGE胶制备过程中，丙烯酰胺，TEMED，TBE等都比较少出现问题，新买的或是新配置的，过硫酸铵会经常出现问题。比如过期过硫酸铵放了一个晚上也没有凝固。即使是新买的，几乎没有完全按照标准的量添加，而是１.５－２倍左右。

前面也有人提到碰到胶不凝的情况，综合来说，一般问题就出在过硫酸铵和TEMED，所以一般我们的过硫酸铵买来立刻分成小份，同时使用时现配现用，TEMED也一样分成小份。

3、电泳缓冲液与配胶的缓冲液一定要一样，0.5的TBE缓冲液比TAE缓冲液效果好些.

6、其它

1）加样：电泳时尽可能把酶切体系的20ul全部加入。加样时，枪尖要在胶孔上方缓慢加入，加到最后不要吹净，防止气泡把样品从胶孔中带出！如果加样尽量快，防止先前加入的样品在电泳液中扩散！

2）估计DNA浓度
Takara的DNAMarkerDL2000+15000，从电泳上估计DNA浓度呢的方法?
该Marker上样量为5ul时，1000bp 和250bp为100ng，其余条带为50ng，我习惯将样品连续稀释，各取1ul上样，根据与Maker相比亮度接近的大约在50ng/ul，算上稀释倍数，估计样品浓度。

3）测序：我是把胶抠了TE泡2天再扩增，纯化的质量好，测序结果很好。