【旧贴整理】花了2星期系统归纳关于PCR的各位老师旧帖,与大家分享-引物
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一 设计引物应遵循以下原则：
1 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
2 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们. 引物对的Tm差异不超过5℃， 设计时温度和GC含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，而且引物加个尾影响不大。但要切记BLAST，包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃, 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
4 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
5 引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物5‘端引入酶切位点得黏性末端，随意加入3个保护性碱基，但是要注意不要形成引物二聚体，而且以A或G开头为好。
7 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
8 引物酶切:除非产物非常特异，直接酶切PCR产物效果有时不是很好，还有一般PCR体系里过量的dNTPs会影响酶切效果。酶切后，可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物，获得高纯度得酶切产物，也即是你的黏性目断片断供后边得试验。
9 设计软件: 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
二 引物保存
定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
三 各种PCR的引物设计
1.长距离PCR：
标准PCR的扩增长度在1～2kb间，不能满足中大型基因的扩增。在此背景下产生了长距离PCR。其引物设计原则在标准PCR的基础上还要注意一下几点:
a 、长度一般在25～30bp间；b、两条引物的解链温度趋向相等是非常重要的。如果两条引物的解链温度的差异大于1度，就可能造成错误引导以及一条链的优势扩增等问题。
2.反相PCR：
标准PCR应用于已知片断的扩增。而反相PCR应用于扩增已知片断相邻的未知片断，主要应用于a，产生探针；b，从总RNA中克隆未知cDNA序列；c、研究病毒序列、转基因和转座子的整合点位区域的序列。
其引物设计除了要注意在模板分子上的设置方向外，其它同标准原则。
3、差异显示PCR（DD-PCR）:
次技术的应用在于显示细胞的全部mRNA，通过比较两种细胞或者不同环境中的同种细胞的cDNA扩增产物的电泳条带谱来鉴定基因表达图谱的差异。
其引物有两套，一为锚定引物，一为随机引物。锚定引物是由12个不同引物组成的库，序列是5'TTTTTTTTTTTTXY3'其中X可以是AGC中的任一个，Y可以是ATGC中的任一个。随机引物是由15个不同的，长度为10mer的引物组成。它们的序列都是随机形成的，都应改包含几乎相等的四种单核苷酸，G与C 碱基的平衡分布以及具有低自发形成稳定二级结构的倾向。
4.多重PCR:
多重PCR就是在PCR中使用一对以上的引物同时扩增目的DNA的几个片断，以节省模板、节约时间和减少费用。引物设计在遵守标准PCR引物设计的规则外还要保证反应中所有的引物有相近的熔解温度，引物之间不会发生相互作用，扩增产物大小相近但又能通过电泳分开。
5.热启动PCR
6.降落PCR
这两种PCR只是为了满足特别要求，在标准PCR的基础上进行了一些方法上的改进，而对引物没有什么特殊的要求，按照标准PCR的引物设计原则即可。
1 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
2 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们. 引物对的Tm差异不超过5℃， 设计时温度和GC含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，而且引物加个尾影响不大。但要切记BLAST，包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃, 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
4 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
5 引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物5‘端引入酶切位点得黏性末端，随意加入3个保护性碱基，但是要注意不要形成引物二聚体，而且以A或G开头为好。
7 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
8 引物酶切:除非产物非常特异，直接酶切PCR产物效果有时不是很好，还有一般PCR体系里过量的dNTPs会影响酶切效果。酶切后，可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物，获得高纯度得酶切产物，也即是你的黏性目断片断供后边得试验。
9 设计软件: 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
二 引物保存
定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
三 各种PCR的引物设计
1.长距离PCR：
标准PCR的扩增长度在1～2kb间，不能满足中大型基因的扩增。在此背景下产生了长距离PCR。其引物设计原则在标准PCR的基础上还要注意一下几点:
a 、长度一般在25～30bp间；b、两条引物的解链温度趋向相等是非常重要的。如果两条引物的解链温度的差异大于1度，就可能造成错误引导以及一条链的优势扩增等问题。
2.反相PCR：
标准PCR应用于已知片断的扩增。而反相PCR应用于扩增已知片断相邻的未知片断，主要应用于a，产生探针；b，从总RNA中克隆未知cDNA序列；c、研究病毒序列、转基因和转座子的整合点位区域的序列。
其引物设计除了要注意在模板分子上的设置方向外，其它同标准原则。
3、差异显示PCR（DD-PCR）:
次技术的应用在于显示细胞的全部mRNA，通过比较两种细胞或者不同环境中的同种细胞的cDNA扩增产物的电泳条带谱来鉴定基因表达图谱的差异。
其引物有两套，一为锚定引物，一为随机引物。锚定引物是由12个不同引物组成的库，序列是5'TTTTTTTTTTTTXY3'其中X可以是AGC中的任一个，Y可以是ATGC中的任一个。随机引物是由15个不同的，长度为10mer的引物组成。它们的序列都是随机形成的，都应改包含几乎相等的四种单核苷酸，G与C 碱基的平衡分布以及具有低自发形成稳定二级结构的倾向。
4.多重PCR:
多重PCR就是在PCR中使用一对以上的引物同时扩增目的DNA的几个片断，以节省模板、节约时间和减少费用。引物设计在遵守标准PCR引物设计的规则外还要保证反应中所有的引物有相近的熔解温度，引物之间不会发生相互作用，扩增产物大小相近但又能通过电泳分开。
5.热启动PCR
6.降落PCR
这两种PCR只是为了满足特别要求，在标准PCR的基础上进行了一些方法上的改进，而对引物没有什么特殊的要求，按照标准PCR的引物设计原则即可。
