材料与仪器
小麦种子
壮观霉素 利福平
温室或走入式生长箱 奥绿肥 塑料盆 LB 培养基 MS 培养基 解剖镜 巴龙霉素
壮观霉素 利福平
温室或走入式生长箱 奥绿肥 塑料盆 LB 培养基 MS 培养基 解剖镜 巴龙霉素
步骤
一、材料
1. 植物材料
Crocus 或 Chinese Spring 小麦种子由美国农业部国家种质资源信息中心提供（http: // www . ars- grin . gov / npgs /)。Crocus 为红色硬粒加拿大春小麦种质系 [ 7 ] ，Chinese Spring 小麦常用于遗传学研究（见注 2)。
2. 生长设施
(1) 一个温控温室或走入式生长箱
(2) 标准化盆栽基质，如泥炭土 2 号（Fafard #2) (Knoxville Seed and Greenhouse)
(3) 通用型奥绿肥 14-14-14 (Osmocote) (Hummert International)
(4) 6 in（1 in = 0.0254 m，后同）塑料盆
3. 农杆菌的培养
(1) 利用标准电激转化法获得的甘油冻存农杆菌单克隆，携带具有 pBECKSred 质粒载体的 AGL1 或 C58C1 农杆菌菌株 [ 8，9 ] （见注 3) 。
(2) 含有 50 μg/ml 壮观霉素和 50 μg/ml 利福平的 LB 培养基（Fisher Biotech) 。
(3) LB 琼脂平板 [ LB 固体培养基：12 g/L 的琼脂粉（Fisher) ，50 μg/ml 壮观霉素，50 μg/ml 利福平 ]。
(4) YEP 固体培养基：20 g/L 胰蛋白胨，10 g/L 酵母粉，50 μg/ml 壮观霉素，50 μg/ml 利福平，200 μmol/L 乙酰丁香酮（3'，5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮）。乙酰丁香酮溶解于二甲基亚砜中（DMSO) 。
4. 渗透培养基和农杆菌的处理
(1) 1/2 MS 培养基（Fisher Biotech) [10]：pH 5.8，5% 蔗糖（m/V），0.04% Silwet L-77（V/V），0.5 mmol/L MES（2-N-吗啉代乙磺酸），200 μmol/L 的乙酰丁香酮（见注 4) [ 11，12]。
(2) 容纳 250 ml 液体的小塑料瓶且能够承受高温高压灭菌。
(3) 小且干净的塑料包装袋和用于授粉的玻璃纸袋。
(4) 小剪刀和小镊子。
5. 筛选
(1) 解剖镜
(2) 商用漂白剂（30%）；1000 ppm（1 ppm =10-6，后同）的头孢霉素（Fisher) 备用 [13 ]。
(3) 喷雾用 2% 巴龙霉素（m/F，Fisher) ，内含 0.2%（V/V）表面活性剂吐温 20 [14]。
(4) NPTII ELISA 检测（酶联免疫法）试剂盒（Agdia, Inc， Indiana) 和读数可调在 540 nm 波长的酶标仪一台。
6. Southern 杂交验证 T-DNA 的整合并检测拷贝数
见 第 13 章。
二、方法
1. 小麦的生长条件
(1) 小麦生长的环境温度（温室或气候箱内）不要超过 25℃。最理想的白天温度为 21~25℃，夜间温度为 16°C，且保持 16 h 的光照。
(2) 将含有通用型奥绿肥（Osmocote 14-14-14) 的泥炭土基质（Fafart # 2 ) 培养基装入 6 in 盆中，穴播播种小麦种子。必要时，在基质中再加入其他营养素。
(3) 虽然没有明确要求光强和光质的具体数值范围，但不能够低于 400~500 μE。
(4) 在利用农杆菌浸染小麦花器官转化前一次性浇透水，在农杆菌转化处理后 2 天内不能再次浇水。
2. 农杆菌的培养和 Vir 基因的诱导
(1) 将携带质粒的农杆菌株系（甘油冻存）接种至 5 ml 的 LB 培养基中，加入适当的抗生素，以约 160 r/min 的转速在（22±2 )℃ 条件下培养过夜。
(2) 第 2 天，取 2.5 ml 摇好的新鲜菌液接种于 250 ml YEP 培养基中（含抗生素和 200 μmol/L 的乙酰丁香酮），以 160 r/min 的转速在（22±4 )℃ 条件下培养至光密度为 1.0（OD600）。
3. 渗透培养基
在室温条件下，将含有 YEP/农杆菌的培养基以 6000 r/min 的转速离心 15 min，随后弃掉上清液。轻轻重悬农杆菌到最终浓度 1.0（OD600），处理待转化植株前，再将 Silwet-77 添加至渗透培养基中。
4. 小麦麦穗的准备与农杆菌的处理
(1) 选择孕穗期麦穗（单核小孢子发育的前期、中期和晚期）用于转化。此时的小麦麦穗依然包裹在叶鞘中，长 6~7 cm ( 图 6.1，见注 5 ) 。
(2) 打开叶鞘显露出正在发育的麦穗，其顶端和内部的花由于不育率比较高，可以去掉，也可以保留。其余的花在颖包顶端略下部剪口。
(3) 混匀农杆菌渗透培养基，然后将麦穗浸入培养基里面，浸泡 1~2 min ( 见注 6) 。
(4) 用透明的小塑料袋把浸泡后的麦穗套起来，确保塑料袋在 2 天内能够保持较高的湿度。
(5) 去掉塑料袋，让麦穗恢复正常生长。晾干农杆菌处理过的麦穗，由于植物已接近开花期，要用玻璃纸袋覆盖麦穗以防止麦株之间的交叉授粉，并让代种子自然结实（见注 7) 。
5. 筛选
在用 Southern 杂交鉴定拷贝数、逆转录聚合酶链反应（RT- PCR) 或 Northern 杂交检测目的基因的表达等费时费力的转基因检测方法之前，先用一套简便的方法进行筛选。
6. 种子的可视化检测
(1) 在体式镜下观察，以野生型为对照，筛选胚为红色的代种子（图 6.2 , 见注 8) 。
(2) 选定的转基因种子在 30% 商用漂白粉溶液中摇动并清洗 30 min，以杀死残留的农杆菌，再用灭菌水冲洗 3 次，每次摇动清洗 5 min，随后播种于基质中。
(3) 可选程序：在室温条件下，用 1000 ppm 浓度的头孢霉素处理萌发的转基因苗（步骤 1 的可选程序——第 3.6 节）2 h 以杀死残留的农杆菌 [13]。
7. 在整株水平上，利用 2% 巴龙霉素进行抗性筛选
(1) 待转基因苗和野生型植株长至 3~4 叶期时，喷洒 2%（m/V）的巴龙霉素 [ 含 0.2%（V/V）的吐温表面活性剂 ] [14]。
(2) 待植株继续生长 5~7 天后，分别对抗性和敏感株系进行统计（见注 9 ) ，选择并保留抗性株作为潜在的转基因阳性株。
8. NPTII 基因的 ELISA 筛选
(1) 参考 NPTII ELISA 酶联免疫操作手册（Agdia Inc.) 。
(2) 非常重要的一点是，用野生型对照植物的蛋白提取液溶解试剂盒中的 NPTII 标准样品。
(3) 为了避免假阳性，尽可能选择一个以上的野生型植株作为阴性对照（见注10）。
(4) 选取转基因植株的健康组织，添加 Agdia 蛋白提取液，用微离心管提取并浓缩蛋白质样品（组织质量：缓冲液体积=1 : 5 ) 。用 1 ml 的枪头浸没植物组织，再用杵碾磨，离心 5~10 min（约 12000 r/min 的转速），取上清液保存备用。以上实验过程均在 4°C 条件下操作。
(5) 每个样品尽可能分装一式三份，取出其中一份样品用于 ELISA 检测。
(6) 检测结束后，加入 3 mol/L 的 H2SO4 以终止反应，然后在酶标仪上选择 450 nm 波长进行定量检测。ELISA 读数普遍高于野生型的单株可以初步判断为阳性转化株。
9. 利用 Southern 杂交验证 T-DNA 的整合及检测拷贝数
分别提取转基因植株、野生型对照和质粒基因组 DNA，待 DNA 酶解消化完全后，经琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行分离、转膜，最后用目的基因的互补探针进行杂交检测。见第 13 章。
1. 植物材料
Crocus 或 Chinese Spring 小麦种子由美国农业部国家种质资源信息中心提供（http: // www . ars- grin . gov / npgs /)。Crocus 为红色硬粒加拿大春小麦种质系 [ 7 ] ，Chinese Spring 小麦常用于遗传学研究（见注 2)。
2. 生长设施
(1) 一个温控温室或走入式生长箱
(2) 标准化盆栽基质，如泥炭土 2 号（Fafard #2) (Knoxville Seed and Greenhouse)
(3) 通用型奥绿肥 14-14-14 (Osmocote) (Hummert International)
(4) 6 in（1 in = 0.0254 m，后同）塑料盆
3. 农杆菌的培养
(1) 利用标准电激转化法获得的甘油冻存农杆菌单克隆，携带具有 pBECKSred 质粒载体的 AGL1 或 C58C1 农杆菌菌株 [ 8，9 ] （见注 3) 。
(2) 含有 50 μg/ml 壮观霉素和 50 μg/ml 利福平的 LB 培养基（Fisher Biotech) 。
(3) LB 琼脂平板 [ LB 固体培养基：12 g/L 的琼脂粉（Fisher) ，50 μg/ml 壮观霉素，50 μg/ml 利福平 ]。
(4) YEP 固体培养基：20 g/L 胰蛋白胨，10 g/L 酵母粉，50 μg/ml 壮观霉素，50 μg/ml 利福平，200 μmol/L 乙酰丁香酮（3'，5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮）。乙酰丁香酮溶解于二甲基亚砜中（DMSO) 。
4. 渗透培养基和农杆菌的处理
(1) 1/2 MS 培养基（Fisher Biotech) [10]：pH 5.8，5% 蔗糖（m/V），0.04% Silwet L-77（V/V），0.5 mmol/L MES（2-N-吗啉代乙磺酸），200 μmol/L 的乙酰丁香酮（见注 4) [ 11，12]。
(2) 容纳 250 ml 液体的小塑料瓶且能够承受高温高压灭菌。
(3) 小且干净的塑料包装袋和用于授粉的玻璃纸袋。
(4) 小剪刀和小镊子。
5. 筛选
(1) 解剖镜
(2) 商用漂白剂（30%）；1000 ppm（1 ppm =10-6，后同）的头孢霉素（Fisher) 备用 [13 ]。
(3) 喷雾用 2% 巴龙霉素（m/F，Fisher) ，内含 0.2%（V/V）表面活性剂吐温 20 [14]。
(4) NPTII ELISA 检测（酶联免疫法）试剂盒（Agdia, Inc， Indiana) 和读数可调在 540 nm 波长的酶标仪一台。
6. Southern 杂交验证 T-DNA 的整合并检测拷贝数
见 第 13 章。
二、方法
1. 小麦的生长条件
(1) 小麦生长的环境温度（温室或气候箱内）不要超过 25℃。最理想的白天温度为 21~25℃，夜间温度为 16°C，且保持 16 h 的光照。
(2) 将含有通用型奥绿肥（Osmocote 14-14-14) 的泥炭土基质（Fafart # 2 ) 培养基装入 6 in 盆中，穴播播种小麦种子。必要时，在基质中再加入其他营养素。
(3) 虽然没有明确要求光强和光质的具体数值范围，但不能够低于 400~500 μE。
(4) 在利用农杆菌浸染小麦花器官转化前一次性浇透水，在农杆菌转化处理后 2 天内不能再次浇水。
2. 农杆菌的培养和 Vir 基因的诱导
(1) 将携带质粒的农杆菌株系（甘油冻存）接种至 5 ml 的 LB 培养基中，加入适当的抗生素，以约 160 r/min 的转速在（22±2 )℃ 条件下培养过夜。
(2) 第 2 天，取 2.5 ml 摇好的新鲜菌液接种于 250 ml YEP 培养基中（含抗生素和 200 μmol/L 的乙酰丁香酮），以 160 r/min 的转速在（22±4 )℃ 条件下培养至光密度为 1.0（OD600）。
3. 渗透培养基
在室温条件下，将含有 YEP/农杆菌的培养基以 6000 r/min 的转速离心 15 min，随后弃掉上清液。轻轻重悬农杆菌到最终浓度 1.0（OD600），处理待转化植株前，再将 Silwet-77 添加至渗透培养基中。
4. 小麦麦穗的准备与农杆菌的处理
(1) 选择孕穗期麦穗（单核小孢子发育的前期、中期和晚期）用于转化。此时的小麦麦穗依然包裹在叶鞘中，长 6~7 cm ( 图 6.1，见注 5 ) 。
(2) 打开叶鞘显露出正在发育的麦穗，其顶端和内部的花由于不育率比较高，可以去掉，也可以保留。其余的花在颖包顶端略下部剪口。
(3) 混匀农杆菌渗透培养基，然后将麦穗浸入培养基里面，浸泡 1~2 min ( 见注 6) 。
(4) 用透明的小塑料袋把浸泡后的麦穗套起来，确保塑料袋在 2 天内能够保持较高的湿度。
(5) 去掉塑料袋，让麦穗恢复正常生长。晾干农杆菌处理过的麦穗，由于植物已接近开花期，要用玻璃纸袋覆盖麦穗以防止麦株之间的交叉授粉，并让代种子自然结实（见注 7) 。
5. 筛选
在用 Southern 杂交鉴定拷贝数、逆转录聚合酶链反应（RT- PCR) 或 Northern 杂交检测目的基因的表达等费时费力的转基因检测方法之前，先用一套简便的方法进行筛选。
6. 种子的可视化检测
(1) 在体式镜下观察，以野生型为对照，筛选胚为红色的代种子（图 6.2 , 见注 8) 。
(2) 选定的转基因种子在 30% 商用漂白粉溶液中摇动并清洗 30 min，以杀死残留的农杆菌，再用灭菌水冲洗 3 次，每次摇动清洗 5 min，随后播种于基质中。
(3) 可选程序：在室温条件下，用 1000 ppm 浓度的头孢霉素处理萌发的转基因苗（步骤 1 的可选程序——第 3.6 节）2 h 以杀死残留的农杆菌 [13]。
7. 在整株水平上，利用 2% 巴龙霉素进行抗性筛选
(1) 待转基因苗和野生型植株长至 3~4 叶期时，喷洒 2%（m/V）的巴龙霉素 [ 含 0.2%（V/V）的吐温表面活性剂 ] [14]。
(2) 待植株继续生长 5~7 天后，分别对抗性和敏感株系进行统计（见注 9 ) ，选择并保留抗性株作为潜在的转基因阳性株。
8. NPTII 基因的 ELISA 筛选
(1) 参考 NPTII ELISA 酶联免疫操作手册（Agdia Inc.) 。
(2) 非常重要的一点是，用野生型对照植物的蛋白提取液溶解试剂盒中的 NPTII 标准样品。
(3) 为了避免假阳性，尽可能选择一个以上的野生型植株作为阴性对照（见注10）。
(4) 选取转基因植株的健康组织，添加 Agdia 蛋白提取液，用微离心管提取并浓缩蛋白质样品（组织质量：缓冲液体积=1 : 5 ) 。用 1 ml 的枪头浸没植物组织，再用杵碾磨，离心 5~10 min（约 12000 r/min 的转速），取上清液保存备用。以上实验过程均在 4°C 条件下操作。
(5) 每个样品尽可能分装一式三份，取出其中一份样品用于 ELISA 检测。
(6) 检测结束后，加入 3 mol/L 的 H2SO4 以终止反应，然后在酶标仪上选择 450 nm 波长进行定量检测。ELISA 读数普遍高于野生型的单株可以初步判断为阳性转化株。
9. 利用 Southern 杂交验证 T-DNA 的整合及检测拷贝数
分别提取转基因植株、野生型对照和质粒基因组 DNA，待 DNA 酶解消化完全后，经琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行分离、转膜，最后用目的基因的互补探针进行杂交检测。见第 13 章。
来源：丁香实验
