优化你的类器官培养水凝胶选择
默克生命科学
2906
目前用的水凝胶效果不太尽如人意？
不同组织的类器官培养到底有没有组织特异性水凝胶可以挑选？
我有特殊实验需求，现在传统水凝胶不能满足我，有没有新型黑科技水凝胶？
那就来看看下面这些实验方案吧。
· 了解最常见的ECM基质胶
· 适用于干细胞类器官研究的水凝胶
· 无动物源干扰、批次一致性强、并且可以根据实验需求变化组分的仿生合成水凝胶
· 从不同组织中提取的组织特异性水凝胶
基底膜的主要成分是层粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白和硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)。前三种蛋白的摩尔含量一般差不多相等，HSPG的含量则偏低，但是鉴于ECM Gel是生物提取物，我们不能确定各成分的准确浓度。
ECM Gel来源于细胞裂解物还是真正的细胞基质？
ECM Gel基质胶由整个EHS肿瘤（不是分离细胞）制备而成。它是肿瘤的全提取产物。
ECM基质胶与Matrigel®(Corning)、Geltrex®(Thermo)或Cultrex®(Trevigen)一样吗？
ECM Gel基质胶是这些产品的生物等效品，ECM基质胶（E6909，E1270）由默克公司生产。
ECM Gel基质胶有添加粘附因子吗？
E1270产品从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取而来，没有添加任何外源添加剂。
ECM Gel基质胶中的钙浓度是多少？
ECM溶液中的CaCl2浓度约为0.265 mg/mL。
ECM Gel基质胶中含有抗生素吗？
我们的ECM Gel胶中添加了庆大霉素。
你们有用不含丙酮酸钠的DMEM溶解的E1270吗？
E1270制品中所用的DMEM不含丙酮酸钠。
ECM Gel基质胶有经过小鼠逆转录病毒测试吗？
E1270产品未经过病毒测试。不过，我们已检测过多批产品，确定其不含乳酸脱氢酶增高病毒(LDEV)，而且我们的原料供应商Harlan在他们的无特定病原体级(SPF)动物检测清单中加入了LDEV检测项目，因此原料(小鼠)中也不含此病毒。此外，通过风险评估确定，RNA病毒无法在生产过程中存活下来。综合以上三点，我们基本可以确定本品不含LDEV。
冻融循环后，ECM Gel基质胶还适合进行3D细胞培养吗？
我们不建议对ECM Gel基质胶产品进行解冻和再冷冻操作。可改将凝胶倒入平板，在2-8° C下储存。储存凝胶要封牢以免脱水和裂开。
E1270数据表上写着凝胶可稀释到2倍(diluted up to twofold)。这是什么意思？
ECM Gel可用杜氏改良Eagle培养基(DMEM)稀释到2倍。意为ECM Gel可用等量的低温DMEM稀释。
这种凝胶加入细胞后会降解吗？
我们确知，本品在与细胞共培养7天后并没有降解。
我该如何从ECM Gel基质胶中回收细胞？
分散酶(D4818)是芽孢杆菌来源的中性蛋白酶，推荐用于ECM Gel基质胶（货号E1270）培养的细胞回收。分散酶的单细胞生产效率远高于胰蛋白酶、胶原蛋白酶或其他蛋白分解酶。分散酶性质温和，回收细胞不会受损，仍可用于传代培养。
1.使用前一天，在2-8 °C冰箱中解冻ECM凝胶基质（CC131）。解冻后，将ECM凝胶始终置于冰上，并使用预先冷却的培养基和移液器，以避免产品凝胶化。
2.用冷的DMEM/F12（D6421）培养基稀释ECM凝胶基质（CC131），稀释比例为1:80。 根据所需的体积按相应比例上调或下调。 以下是用1.5 mL 1:80稀释的ECM凝胶包被6孔板的示例。
首先进行1:20稀释，操作步骤是，在15 mL锥形管中，将0.5 mL ECM凝胶加入9.5 mL冷的DMEM / F12或DMEM培养基中。 总体积 = 10 mL.
需要进一步稀释4倍才能稀释成最终的1:80。 将2.5 mL 1:20稀释的ECM凝胶加入7.5 mL冷的DMEM / F12培养基中。 总体积 = 10 mL
注意：建议的稀释度为1:80，但如果需要，可以使用更浓缩的干细胞合格ECM凝胶。
3.将1.5 mL 1:80稀释的ECM凝胶基质（CC131）加入6孔板的每个孔中。 涡旋培养板，以使ECM凝胶基质均匀地铺展在板的表面上。 使用前，将其存放在2-8°C的冰箱中冷藏过夜或至少2小时。 如果不立即使用，用保鲜膜将ECM包被的培养板包好，并储存于2-8 °C下直至准备使用。应在3-4天内使用ECM包被的培养板。
4.在接种细胞之前，将板放回到室温下10-15分钟，除去包被溶液，然后每孔加入3 mL人ES/iPSC生长培养基（SCM130）。现在可将细胞接种到新包被的平板上。
实验方法1：TrueGel3D™水凝胶细胞可降解CD交联剂和RGD肽(TRUE1)制备方案
TrueGel3D™水凝胶CD细胞可降解交联剂和RGD肽(TRUE1)是预配置的试剂组合，为细胞生长提供性质标准的3D水凝胶：
· 适中密度提供适合各种细胞的生长环境
· RGD基序预定浓度适合细胞粘附
· CD（细胞可降解）交联剂让细胞可以在水凝胶内自由地铺展和迁移
· 3D培养实验完成后可采用TrueGel3D™酶促细胞回收液回收细胞，以便用于下游分析
当3D水凝胶实验方案的最佳应用条件尚未确定，或者凝胶硬度无需优化时，可选择TRUE1（TrueGel3D™水凝胶CD细胞可降解交联剂和RGD肽）作为起步配置。
为了尽量减少巯基氧化，非必要时，勿将CD细胞可降解交联剂暴露于空气和室温。每次使用后务必迅速盖回试剂盖。
采用培养基、PBS或生理溶液配制储备细胞悬液或其他生物样本。
水凝胶混合液配制：
细胞悬液应占最终凝胶体积的1/5。相应地，配制完成凝胶的最终细胞浓度会是储备细胞悬液浓度的1/5。
表1. TRUE1（TrueGel3D™水凝胶CD细胞可降解交联剂和RGD肽）构建水凝胶所需试剂体积
2.在反应管中，将RGD可降解聚合物加到细胞悬液中，温和混匀。将CD细胞可降解交联剂加到混合液中，温和地上下吹吸数次混匀。
3.凝固前将混合液接种到合适的培养皿中。
注意：混合液在开始凝固前会保持1-4分钟的液体形态：务必在这段时间内加好全部混合液。
~undefined 可使用多孔板（6、24或96孔）或任意的无菌培养板或培养瓶。推荐使用未经组织培养处理的聚苯乙烯。如需细胞成像，建议采用带细胞培养腔室的载玻片，比如Millicell® EZ SLIDE 8孔无菌腔室载玻片（货号PEZGS0816）
4.混合液37 0C孵育20分钟。也可以室温孵育，但凝固所需时间更久。
5.吸头轻触凝胶，检查凝胶是否形成。收回吸头后，吸头表面没有凝胶线代表成胶。
6.加入充足的培养基覆盖凝胶。
7.培养皿或培养瓶盖上盖子，在组织培养箱中培养。
8.培养1小时后，更换培养基（换液）。
9.细胞培养期间按照要求换液。
采用TrueGel3D™酶促细胞回收液溶解TrueGel3D™水凝胶细胞
向培养基中添加TrueGel3D™酶促细胞回收液，可溶解TrueGel3D™水凝胶以回收活细胞或化学固定细胞。例如，30 μL凝胶可用培养基1:20稀释的300 μL TrueGel3D™酶促细胞回收液溶解（37 °C孵育30-60分钟）。凝胶溶解后，细胞悬液离心，并用新鲜培养基或生理缓冲液重悬沉淀细胞。重复此洗涤步骤一两次，去除残留的TrueGel3D™酶促细胞回收液。如若细胞要再次进行葡聚糖水凝胶包埋并继续培养，除酶操作尤其重要。如果TrueGel3D™酶促细胞回收液没有彻底清除，会使新形成的水凝胶不稳定。
如果制备的是小体积凝胶（小于100 μL），只需使用极少量的TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽储液。建议用水稀释TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽储液（从20 mmol/L降到3 mmol/L），使移液更加便利。如果稀释了粘附肽储液，相应地必须减少混合液中的水量，以保持最终体积不变。
同时制备多块相同凝胶：
制备相同成分的多块凝胶时，可将水、TrueGel3D™缓冲液、巯基反应性聚合物（SLO-PVA或SLO-DEXTRAN）、TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽（如适用）、细胞悬液和交联剂的最终混合液放大为单份预混液，再进行分装。分装前充分混匀，确保每块凝胶的用量相等。
制备不含细胞的普通凝胶或包埋其他标本：
如果凝胶中不含细胞，比如用于组织包埋或制备普通凝胶，将配比方案中规定的细胞悬液用量替换成细胞培养基、PBS或其他任意的生理相容性溶液（自行选择）。
替换TrueGel3D RGD整合素粘附肽制备实验对照：
TrueGel3D™硫代甘油可替代TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽加到凝胶中。这样构建的凝胶不含细胞粘附位点，可作为RGD肽改性凝胶的对照。TrueGel3D™随机RGD整合素粘附肽（货号TRUESRGD-1EA和TRUESRGD-3EA)也可用于对照实验。
实验方法2： TrueGel3D™快速水凝胶制备方案
TrueGel3D™中的聚合物分为两种：聚乙烯醇(PVA)和葡聚糖，前者是人工合成的不可降解聚合物，后者可通过TrueGel3D™酶促细胞回收液降解。两种聚合物都经快速或慢速巯基(SH)反应性基团官能化。
快速巯基反应性基团包括聚合物骨架中的马来酰亚胺基，它与交联剂快速反应形成水凝胶，根据所用凝胶成分和pH的不同在数秒到数分钟内不等。
TrueGel3D™缓冲液务必要充分溶解。不能用冰冷却缓冲液，不然会导致缓冲盐结晶。
为了尽量减少巯基氧化，非必要时，勿将RGD整合素粘附肽、PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂暴露于空气和室温。每次使用后务必迅速盖回试剂盖。
采用培养基、PBS或生理溶液配制储备用细胞悬液或其他生物样本。
使用TrueGel3D™水凝胶快速构建试剂盒时，可以修改和优化不同参数。表1提供了使用或不使用TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽或蛋白制备软水凝胶的试剂体积。
表1.使用或不使用TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽或蛋白快速构建软水凝胶的试剂体积
2.（如果不需要加入TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽，跳至步骤3）。加入TrueGel3D™ 整合素粘附肽，立即混匀，确保FAST巯基反应性聚合物与多肽均匀反应。样品孵育20 min，使RGD肽连接到聚合物的马来酰亚胺基上。
3.将交联剂（PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂）加到无菌培养皿表面。交联剂不要铺开，要保持单滴的液滴形式。
~undefined 可使用多孔板（6、24或96孔）或适用的无菌培养板或培养瓶。推荐使用未经组织培养处理的聚苯乙烯。如需细胞成像，建议使用带细胞培养腔室的载玻片，比如Millicell® EZ SLIDE 8孔无菌腔室载玻片（货号PEZGS0816）
4.在含有水、缓冲液、FAST巯基反应性聚合物和TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽（如适用）的反应管中加入细胞悬液和蛋白质（如适用）。
5.吸取27 μL混合液（如未加蛋白质）或24 μL混合液（如加入蛋白质），加到预加交联剂的细胞培养皿中，上下吹吸三次快速混匀，小心防止气泡形成。静置。约等3分钟，凝胶形成。
6.将足够覆盖凝胶的细胞培养基加入细胞培养皿。
7.培养皿放到组织培养箱中培养。
8.培养1小时后，更换培养基（换液）。
9.细胞培养期间按照要求换液。.
注意：TrueGel3D™水凝胶的化学性质决定了混匀数秒后就会开始形成凝胶。因此，要尽可能快速地进行混匀操作，避免吸头中有凝胶形成。加入细胞培养基之前，可用吸头轻触凝胶，检查是否成胶。
实验方法3： TrueGel3D™慢速水凝胶制备方案
TrueGel3D™中的聚合物分为两种：聚乙烯醇(PVA)和葡聚糖，前者是人工合成的不可降解聚合物，后者可通过TrueGel3D™酶促细胞回收液降解。两种聚合物都经快速或慢速巯基(thiol)反应性基团官能化。
慢速胶凝聚合物SLO-PVA和SLO-DEXTRAN可以缓慢的胶凝速度构建水凝胶，适合用于微通道或注射器填充之类的应用。形成固体水凝胶所需孵育时间为8到50分钟，具体取决于所选聚合物和交联剂（CD细胞可降解交联剂或PEG细胞不可降解交联剂）。
TrueGel3D™缓冲液务必要充分溶解。不要用冰冷却缓冲液，不然会导致缓冲盐结晶。
为了尽量减少巯基氧化，非必要时，勿将RGD整合素粘附肽、PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂暴露于空气和室温。每次使用后务必迅速盖
采用培养基、PBS或生理溶液配制储备细胞悬液或其他生物样本。
水凝胶混合液制备注意事项：
使用TrueGel3D™水凝胶慢速构建试剂盒时，可以修改和优化不同参数。表1提供了使用或不使用TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽或蛋白制备软水凝胶的标准配比方案
表1.使用或不使用TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽或蛋白慢速构建软水凝胶所需试剂体积
操作步骤
1.在反应管中加入水、TrueGel3D™缓冲液(pH 7.2)和SLO巯基反应性聚合物（SLO-PVA或SLO-DEXTRAN）。充分混匀。
2.（如果不需要加入TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽，跳至步骤3）。加入TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽，立即混匀。样品孵育20 min，使RGD肽连接到聚合物上。
3.在含有水、缓冲液、SLO巯基反应性聚合物和TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽（如适用）的反应管中加入细胞悬液和蛋白质（如适用）。根据需要在混合液中加入交联剂：根据所选交联剂选择相应的操作方案：
A- CD细胞可降解交联剂交联： 混合液会在在1分钟内开始形成凝胶，并且变得不可抽吸。转入合适的细胞培养皿之前，通过温和抽吸重悬细胞，确保细胞会悬浮在凝胶中。25 min后（加入细胞培养基之前），可用吸头轻触凝胶，检查是否成胶。
B-PEG细胞不可降解交联剂交联：混合液会持续液态10分钟之久，才会开始形成凝胶。开始成胶后，混合物就会变得不可抽吸。可利用这段时间将混合液转入合适的无菌培养皿中，不过在胶凝开始前，需要混合或搅动来重悬细胞，确保细胞会悬浮在凝胶中。完成胶凝约需50分钟孵育时间。加入细胞培养基之前，可用吸头轻触凝胶，检查是否成胶。
~undefined 培养器皿可选择多孔板（6、24、96孔）或任意的无菌培养板或培养瓶。推荐使用未经组织培养处理的聚苯乙烯。如需细胞成像，建议采用带细胞培养腔室的载玻片，比如Millicell® EZ SLIDE 8孔无菌腔室载玻片（货号PEZGS0816）
4.将足够覆盖凝胶的细胞培养基加入细胞培养皿。
5.培养皿放到组织培养箱中培养。
6.1小时后换液。
7.细胞培养期间按照要求换液。
实验方法4： 使用TrueGel3D®HTS水凝胶板进行高通量3D细胞培养
TrueGel3D®HTS水凝胶平板是一种现成的解决方案，可使用完全合成的水凝胶以简单且自动化兼容的方式轻松建立3D细胞培养。在这里，我们展示了如何使用TrueGel3D®HTS水凝胶板，按照优化的逐步方案，将人类脂肪（HA）来源的干细胞扩增并分化为脂肪细胞或骨细胞。
实验结果
图1。使用TrueGel3D®HTS水凝胶板扩增人骨髓间充质干细胞。使用共焦显微镜获得的TrueGel3D®HTS水凝胶板，对3D培养的第4天人类脂肪间充质干细胞进行荧光染色。间充质干细胞表达胶原、纤维连接蛋白，并显示复杂的三维形态。
图2. 使用TrueGel3D®HTS水凝胶板分化人骨髓间充质干细胞。使用共焦显微镜获得的TrueGel3D®HTS水凝胶板，对第14天培养的人脂肪间充质干细胞进行Oil-Red-O和ALP染色。
图3. NHBE原代细胞气液界面培养。正常人支气管上皮(NHBE)原代细胞气液界面培养(ALI)21天。在dECM肺水凝胶中培养的NHBE细胞形成组织性和复杂度更高的分层管腔结构，重现人呼吸道细胞结构，平均直径远超Matrige®基质。
用于3D细胞培养的dECM肝水凝胶
用于3D细胞培养的dECM骨水凝胶
图5. 人肝细胞原代培养。相比Matrigel®基质或I型胶原蛋白，在dECM肝水凝胶中培养的原代人肝细胞明显表达更多的LDL受体(A)，分泌更多的纤维蛋白原。相比Matrigel®基质或I型胶原蛋白，在dECM肝水凝胶中培养的原代人肝细胞明显形成更多的3D结构(C)，具有更高的细胞色素P450活性(D)，累积更多的糖原(E)。
图6. 原代人成骨细胞培养。原代人成骨细胞在dECM骨水凝胶(6 mg/mL)中培养1小时后，出现了特征性的树突形态。培养7天后，相比Matrigel®基质或I型胶原蛋白，在dECM骨水凝胶中培养的成骨细胞具有更高的碱性磷酸酶活性。
图7. 乳腺癌转移检测。采用dECM水凝胶构建乳腺癌骨转移模型，培养的乳腺癌亚型细胞对药物的反应异于塑料基质。(A)BT-549细胞和(B)T47-D细胞对药物（紫杉醇，5 µM）和溶剂对照(DMSO)处理48小时后的反应。
用于2D和3D细胞培养的dECM脱细胞基质水凝胶
不同组织的类器官培养到底有没有组织特异性水凝胶可以挑选？
我有特殊实验需求，现在传统水凝胶不能满足我，有没有新型黑科技水凝胶？
那就来看看下面这些实验方案吧。
· 了解最常见的ECM基质胶
· 适用于干细胞类器官研究的水凝胶
· 无动物源干扰、批次一致性强、并且可以根据实验需求变化组分的仿生合成水凝胶
· 从不同组织中提取的组织特异性水凝胶
了解常见的ECM基质胶
ECM Gel 基质胶的成分？基底膜的主要成分是层粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白和硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)。前三种蛋白的摩尔含量一般差不多相等，HSPG的含量则偏低，但是鉴于ECM Gel是生物提取物，我们不能确定各成分的准确浓度。
ECM Gel来源于细胞裂解物还是真正的细胞基质？
ECM Gel基质胶由整个EHS肿瘤（不是分离细胞）制备而成。它是肿瘤的全提取产物。
ECM基质胶与Matrigel®(Corning)、Geltrex®(Thermo)或Cultrex®(Trevigen)一样吗？
ECM Gel基质胶是这些产品的生物等效品，ECM基质胶（E6909，E1270）由默克公司生产。
ECM Gel基质胶有添加粘附因子吗？
E1270产品从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取而来，没有添加任何外源添加剂。
ECM Gel基质胶中的钙浓度是多少？
ECM溶液中的CaCl2浓度约为0.265 mg/mL。
ECM Gel基质胶中含有抗生素吗？
我们的ECM Gel胶中添加了庆大霉素。
你们有用不含丙酮酸钠的DMEM溶解的E1270吗？
E1270制品中所用的DMEM不含丙酮酸钠。
ECM Gel基质胶有经过小鼠逆转录病毒测试吗？
E1270产品未经过病毒测试。不过，我们已检测过多批产品，确定其不含乳酸脱氢酶增高病毒(LDEV)，而且我们的原料供应商Harlan在他们的无特定病原体级(SPF)动物检测清单中加入了LDEV检测项目，因此原料(小鼠)中也不含此病毒。此外，通过风险评估确定，RNA病毒无法在生产过程中存活下来。综合以上三点，我们基本可以确定本品不含LDEV。
冻融循环后，ECM Gel基质胶还适合进行3D细胞培养吗？
我们不建议对ECM Gel基质胶产品进行解冻和再冷冻操作。可改将凝胶倒入平板，在2-8° C下储存。储存凝胶要封牢以免脱水和裂开。
E1270数据表上写着凝胶可稀释到2倍(diluted up to twofold)。这是什么意思？
ECM Gel可用杜氏改良Eagle培养基(DMEM)稀释到2倍。意为ECM Gel可用等量的低温DMEM稀释。
这种凝胶加入细胞后会降解吗？
我们确知，本品在与细胞共培养7天后并没有降解。
我该如何从ECM Gel基质胶中回收细胞？
分散酶(D4818)是芽孢杆菌来源的中性蛋白酶，推荐用于ECM Gel基质胶（货号E1270）培养的细胞回收。分散酶的单细胞生产效率远高于胰蛋白酶、胶原蛋白酶或其他蛋白分解酶。分散酶性质温和，回收细胞不会受损，仍可用于传代培养。
适用于干细胞类器官研究的基底膜提取物（BME）的制备
干细胞合格的ECM凝胶基质（CC131）是从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肿瘤中纯化的可溶性基底膜提取物（BME），其已被预先鉴定用于人ES/iPS细胞培养。基质在20-40 °C下聚合，形成重构的基底膜。该产品含有层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素等ECM。该基质省却了耗时的预筛选和批次识别的需要，为多能人ES/iPS细胞的长期培养提供了所需的优化ECM包被，并支持在多种无血清/无饲养层人ES/iPS扩增培养基（例如，mTeSR®、PluriSTEM™）中培养人ES/iPS细胞。以下是使用干细胞合格的ECM凝胶基质包被6孔板的一般指南。 所有操作程序均应在生物安全柜中的无菌条件下进行。1.使用前一天，在2-8 °C冰箱中解冻ECM凝胶基质（CC131）。解冻后，将ECM凝胶始终置于冰上，并使用预先冷却的培养基和移液器，以避免产品凝胶化。
2.用冷的DMEM/F12（D6421）培养基稀释ECM凝胶基质（CC131），稀释比例为1:80。 根据所需的体积按相应比例上调或下调。 以下是用1.5 mL 1:80稀释的ECM凝胶包被6孔板的示例。
首先进行1:20稀释，操作步骤是，在15 mL锥形管中，将0.5 mL ECM凝胶加入9.5 mL冷的DMEM / F12或DMEM培养基中。 总体积 = 10 mL.
需要进一步稀释4倍才能稀释成最终的1:80。 将2.5 mL 1:20稀释的ECM凝胶加入7.5 mL冷的DMEM / F12培养基中。 总体积 = 10 mL
注意：建议的稀释度为1:80，但如果需要，可以使用更浓缩的干细胞合格ECM凝胶。
3.将1.5 mL 1:80稀释的ECM凝胶基质（CC131）加入6孔板的每个孔中。 涡旋培养板，以使ECM凝胶基质均匀地铺展在板的表面上。 使用前，将其存放在2-8°C的冰箱中冷藏过夜或至少2小时。 如果不立即使用，用保鲜膜将ECM包被的培养板包好，并储存于2-8 °C下直至准备使用。应在3-4天内使用ECM包被的培养板。
4.在接种细胞之前，将板放回到室温下10-15分钟，除去包被溶液，然后每孔加入3 mL人ES/iPSC生长培养基（SCM130）。现在可将细胞接种到新包被的平板上。
仿生合成水凝胶TrueGel3D™
TrueGel3D™是一种由混合聚合物与交联剂混合而成的生化成分限定的水凝胶。与其他基于动物细胞生物提取物（例如小鼠EHS肿瘤细胞）的水凝胶相比，TrueGel3D™不含任何可能会干扰或造成实验污染的动物源成分。其中包含的成分可保持活性，从而可模拟天然细胞外基质(ECM)的关键特征。它们通过支持细胞贴壁生长和迁移来模拟与组织内细胞类似的真实生长环境。TrueGel3D™技术能够提供相关的机制和生化信息，来研究3D环境中细胞的形态和生理特性。最后，与传统的2D细胞培养条件相比，这些水凝胶允许对细胞进行包封，以实现细胞在更贴近天然组织环境的3D环境中进行生长。
TRUEGEL3D™的功能和优点
- TrueGel3D™适用于多种细胞系（MDCK、上皮细胞、成纤维细胞、癌细胞、原代细胞（包括淋巴细胞）、基质和胚胎心肌细胞）。
- TrueGel3D™中形成水凝胶骨架的基本成分（葡聚糖、PVA、PEG）不会干扰细胞行为
- 凝胶透明，支持细胞成像分析
- 基于不同的凝胶速度，多种TrueGel3D™试剂盒可供选，可支持多种应用（见表2汇总）
- 可进行无毒细胞复苏
实验方法和支持
- 实验方法1： TrueGel3D™水凝胶、CD细胞可降解交联剂和RGD肽（TRUE1）制备
- 实验方法2：快速水凝胶制备(True2-5)
- 实验方法3：慢速水凝胶制备(True6-9)
- 实验方法4：使用TrueGel3D®HTS水凝胶板进行高通量3D细胞培养
实验方法1：TrueGel3D™水凝胶细胞可降解CD交联剂和RGD肽(TRUE1)制备方案
TrueGel3D™水凝胶CD细胞可降解交联剂和RGD肽(TRUE1)是预配置的试剂组合，为细胞生长提供性质标准的3D水凝胶：
· 适中密度提供适合各种细胞的生长环境
· RGD基序预定浓度适合细胞粘附
· CD（细胞可降解）交联剂让细胞可以在水凝胶内自由地铺展和迁移
· 3D培养实验完成后可采用TrueGel3D™酶促细胞回收液回收细胞，以便用于下游分析
当3D水凝胶实验方案的最佳应用条件尚未确定，或者凝胶硬度无需优化时，可选择TRUE1（TrueGel3D™水凝胶CD细胞可降解交联剂和RGD肽）作为起步配置。
试剂准备
按照产品说明书（datesheet或information sheet）准备试剂。为了尽量减少巯基氧化，非必要时，勿将CD细胞可降解交联剂暴露于空气和室温。每次使用后务必迅速盖回试剂盖。
采用培养基、PBS或生理溶液配制储备细胞悬液或其他生物样本。
实验步骤
切记：开始混合试剂前，务必通读完整实验方案。水凝胶混合液配制：
细胞悬液应占最终凝胶体积的1/5。相应地，配制完成凝胶的最终细胞浓度会是储备细胞悬液浓度的1/5。
| 试剂 | 不同最终凝胶体积下的试剂体积，µL | ||
| 巯基反应性RGD可降解聚合物 | 18 | 36 | 72 |
| CD细胞可降解交联剂 | 2 | 4 | 8 |
| 细胞悬液 | 5 | 10 | 20 |
| 总 | 25 | 50 | 100 |
操作步骤
1. 用培养基、PBS或其他任意生理溶液配制细胞悬液。2.在反应管中，将RGD可降解聚合物加到细胞悬液中，温和混匀。将CD细胞可降解交联剂加到混合液中，温和地上下吹吸数次混匀。
3.凝固前将混合液接种到合适的培养皿中。
注意：混合液在开始凝固前会保持1-4分钟的液体形态：务必在这段时间内加好全部混合液。
~undefined 可使用多孔板（6、24或96孔）或任意的无菌培养板或培养瓶。推荐使用未经组织培养处理的聚苯乙烯。如需细胞成像，建议采用带细胞培养腔室的载玻片，比如Millicell® EZ SLIDE 8孔无菌腔室载玻片（货号PEZGS0816）
4.混合液37 0C孵育20分钟。也可以室温孵育，但凝固所需时间更久。
5.吸头轻触凝胶，检查凝胶是否形成。收回吸头后，吸头表面没有凝胶线代表成胶。
6.加入充足的培养基覆盖凝胶。
7.培养皿或培养瓶盖上盖子，在组织培养箱中培养。
8.培养1小时后，更换培养基（换液）。
9.细胞培养期间按照要求换液。
采用TrueGel3D™酶促细胞回收液溶解TrueGel3D™水凝胶细胞
向培养基中添加TrueGel3D™酶促细胞回收液，可溶解TrueGel3D™水凝胶以回收活细胞或化学固定细胞。例如，30 μL凝胶可用培养基1:20稀释的300 μL TrueGel3D™酶促细胞回收液溶解（37 °C孵育30-60分钟）。凝胶溶解后，细胞悬液离心，并用新鲜培养基或生理缓冲液重悬沉淀细胞。重复此洗涤步骤一两次，去除残留的TrueGel3D™酶促细胞回收液。如若细胞要再次进行葡聚糖水凝胶包埋并继续培养，除酶操作尤其重要。如果TrueGel3D™酶促细胞回收液没有彻底清除，会使新形成的水凝胶不稳定。
凝胶多样化制备的细节变动
制备小体积凝胶：如果制备的是小体积凝胶（小于100 μL），只需使用极少量的TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽储液。建议用水稀释TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽储液（从20 mmol/L降到3 mmol/L），使移液更加便利。如果稀释了粘附肽储液，相应地必须减少混合液中的水量，以保持最终体积不变。
同时制备多块相同凝胶：
制备相同成分的多块凝胶时，可将水、TrueGel3D™缓冲液、巯基反应性聚合物（SLO-PVA或SLO-DEXTRAN）、TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽（如适用）、细胞悬液和交联剂的最终混合液放大为单份预混液，再进行分装。分装前充分混匀，确保每块凝胶的用量相等。
制备不含细胞的普通凝胶或包埋其他标本：
如果凝胶中不含细胞，比如用于组织包埋或制备普通凝胶，将配比方案中规定的细胞悬液用量替换成细胞培养基、PBS或其他任意的生理相容性溶液（自行选择）。
替换TrueGel3D RGD整合素粘附肽制备实验对照：
TrueGel3D™硫代甘油可替代TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽加到凝胶中。这样构建的凝胶不含细胞粘附位点，可作为RGD肽改性凝胶的对照。TrueGel3D™随机RGD整合素粘附肽（货号TRUESRGD-1EA和TRUESRGD-3EA)也可用于对照实验。
实验方法2： TrueGel3D™快速水凝胶制备方案
TrueGel3D™中的聚合物分为两种：聚乙烯醇(PVA)和葡聚糖，前者是人工合成的不可降解聚合物，后者可通过TrueGel3D™酶促细胞回收液降解。两种聚合物都经快速或慢速巯基(SH)反应性基团官能化。
快速巯基反应性基团包括聚合物骨架中的马来酰亚胺基，它与交联剂快速反应形成水凝胶，根据所用凝胶成分和pH的不同在数秒到数分钟内不等。
试剂准备
按照产品说明书（datesheet或information sheet）准备试剂。TrueGel3D™缓冲液务必要充分溶解。不能用冰冷却缓冲液，不然会导致缓冲盐结晶。
为了尽量减少巯基氧化，非必要时，勿将RGD整合素粘附肽、PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂暴露于空气和室温。每次使用后务必迅速盖回试剂盖。
采用培养基、PBS或生理溶液配制储备用细胞悬液或其他生物样本。
实验步骤
切记：开始混合试剂前，务必通读完整实验方案。
水凝胶混合液制备注意事项：使用TrueGel3D™水凝胶快速构建试剂盒时，可以修改和优化不同参数。表1提供了使用或不使用TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽或蛋白制备软水凝胶的试剂体积。
| 试剂 | 试剂体积(µL) | ||
| 无TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽 | 有TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽 | 有蛋白质（推荐浓度：200 µg/ml） | |
| 巯基反应性聚合物（FAST-PVA或FAST-DEXTRAN） | 2 | 2.5 | 4 |
| 交联剂（PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂） | 3 | 3 | 6 |
| 细胞悬液 | 6 | 6 | 6 |
| TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽 | - | 0.8 | - |
| 蛋白质(200 µg/ml) | - | - | 4.5 |
| TrueGel3D™缓冲液 pH 5.5 | 2.4 | 2.4 | 2.4 |
| 水 | 16.6 | 15.3 | 7.1 |
| 总体积 | 30 | 30 | 30 |
操作步骤
1.在反应管中加入水、TrueGel3D™缓冲液(pH 5.5)和FAST巯基反应性聚合物（FAST-PVA或FAST-DEXTRAN）。2.（如果不需要加入TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽，跳至步骤3）。加入TrueGel3D™ 整合素粘附肽，立即混匀，确保FAST巯基反应性聚合物与多肽均匀反应。样品孵育20 min，使RGD肽连接到聚合物的马来酰亚胺基上。
3.将交联剂（PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂）加到无菌培养皿表面。交联剂不要铺开，要保持单滴的液滴形式。
~undefined 可使用多孔板（6、24或96孔）或适用的无菌培养板或培养瓶。推荐使用未经组织培养处理的聚苯乙烯。如需细胞成像，建议使用带细胞培养腔室的载玻片，比如Millicell® EZ SLIDE 8孔无菌腔室载玻片（货号PEZGS0816）
4.在含有水、缓冲液、FAST巯基反应性聚合物和TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽（如适用）的反应管中加入细胞悬液和蛋白质（如适用）。
5.吸取27 μL混合液（如未加蛋白质）或24 μL混合液（如加入蛋白质），加到预加交联剂的细胞培养皿中，上下吹吸三次快速混匀，小心防止气泡形成。静置。约等3分钟，凝胶形成。
6.将足够覆盖凝胶的细胞培养基加入细胞培养皿。
7.培养皿放到组织培养箱中培养。
8.培养1小时后，更换培养基（换液）。
9.细胞培养期间按照要求换液。.
注意：TrueGel3D™水凝胶的化学性质决定了混匀数秒后就会开始形成凝胶。因此，要尽可能快速地进行混匀操作，避免吸头中有凝胶形成。加入细胞培养基之前，可用吸头轻触凝胶，检查是否成胶。
实验方法3： TrueGel3D™慢速水凝胶制备方案
TrueGel3D™中的聚合物分为两种：聚乙烯醇(PVA)和葡聚糖，前者是人工合成的不可降解聚合物，后者可通过TrueGel3D™酶促细胞回收液降解。两种聚合物都经快速或慢速巯基(thiol)反应性基团官能化。
慢速胶凝聚合物SLO-PVA和SLO-DEXTRAN可以缓慢的胶凝速度构建水凝胶，适合用于微通道或注射器填充之类的应用。形成固体水凝胶所需孵育时间为8到50分钟，具体取决于所选聚合物和交联剂（CD细胞可降解交联剂或PEG细胞不可降解交联剂）。
试剂准备
按照产品说明书（datesheet或information sheet）准备试剂。TrueGel3D™缓冲液务必要充分溶解。不要用冰冷却缓冲液，不然会导致缓冲盐结晶。
为了尽量减少巯基氧化，非必要时，勿将RGD整合素粘附肽、PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂暴露于空气和室温。每次使用后务必迅速盖
采用培养基、PBS或生理溶液配制储备细胞悬液或其他生物样本。
实验步骤
切记：开始混合试剂前，务必通读完整实验方案。水凝胶混合液制备注意事项：
使用TrueGel3D™水凝胶慢速构建试剂盒时，可以修改和优化不同参数。表1提供了使用或不使用TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽或蛋白制备软水凝胶的标准配比方案
| 试剂 | 试剂体积(µL) | ||
| 无TrueGel RGD整合素粘附肽 | 有TrueGel RGD整合素粘附肽 | 有蛋白质（推荐浓度：200 µg/ml） | |
| 巯基反应性聚合物（SLO-PVA或SLO-DEXTRAN） | 2 | 2.5 | 4 |
| 交联剂（PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂） | 3 | 3 | 6 |
| 细胞悬液 | 6 | 6 | 6 |
| TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽 | - | 0.8 | - |
| 蛋白质(200 µg/ml) | - | - | 4.5 |
| TrueGel3D™缓冲液 pH 7.2 | 2.4 | 2.4 | 2.4 |
| 水 | 16.6 | 15.3 | 7.1 |
| 总 | 30 | 30 | 30 |
操作步骤
1.在反应管中加入水、TrueGel3D™缓冲液(pH 7.2)和SLO巯基反应性聚合物（SLO-PVA或SLO-DEXTRAN）。充分混匀。
2.（如果不需要加入TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽，跳至步骤3）。加入TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽，立即混匀。样品孵育20 min，使RGD肽连接到聚合物上。
3.在含有水、缓冲液、SLO巯基反应性聚合物和TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽（如适用）的反应管中加入细胞悬液和蛋白质（如适用）。根据需要在混合液中加入交联剂：根据所选交联剂选择相应的操作方案：
A- CD细胞可降解交联剂交联： 混合液会在在1分钟内开始形成凝胶，并且变得不可抽吸。转入合适的细胞培养皿之前，通过温和抽吸重悬细胞，确保细胞会悬浮在凝胶中。25 min后（加入细胞培养基之前），可用吸头轻触凝胶，检查是否成胶。
B-PEG细胞不可降解交联剂交联：混合液会持续液态10分钟之久，才会开始形成凝胶。开始成胶后，混合物就会变得不可抽吸。可利用这段时间将混合液转入合适的无菌培养皿中，不过在胶凝开始前，需要混合或搅动来重悬细胞，确保细胞会悬浮在凝胶中。完成胶凝约需50分钟孵育时间。加入细胞培养基之前，可用吸头轻触凝胶，检查是否成胶。
~undefined 培养器皿可选择多孔板（6、24、96孔）或任意的无菌培养板或培养瓶。推荐使用未经组织培养处理的聚苯乙烯。如需细胞成像，建议采用带细胞培养腔室的载玻片，比如Millicell® EZ SLIDE 8孔无菌腔室载玻片（货号PEZGS0816）
4.将足够覆盖凝胶的细胞培养基加入细胞培养皿。
5.培养皿放到组织培养箱中培养。
6.1小时后换液。
7.细胞培养期间按照要求换液。
实验方法4： 使用TrueGel3D®HTS水凝胶板进行高通量3D细胞培养
TrueGel3D®HTS水凝胶平板是一种现成的解决方案，可使用完全合成的水凝胶以简单且自动化兼容的方式轻松建立3D细胞培养。在这里，我们展示了如何使用TrueGel3D®HTS水凝胶板，按照优化的逐步方案，将人类脂肪（HA）来源的干细胞扩增并分化为脂肪细胞或骨细胞。
间充质干细胞方案
人骨髓间充质干细胞的扩增与分化
人脂肪间充质干细胞（SCC038）可以先在组织培养塑料上扩增，然后接种在TrueGel3D®HTS水凝胶板（TRUE-HTS1，TRUE-HTS10）中。或者，细胞可以解冻并直接接种在TrueGel3D®HTS水凝胶板中。在将细胞接种到TrueGel3D®HTS水凝胶板之前，确保细胞处于高活力状态。- 培养基的准备:
- 2D MSC扩增培养基: 向α-MEM (M4526)中添加10% FBS (ES-020-B), 1x 谷氨酰胺 (TMS-002), and 1x P/S 双抗(P4333). 在使用前，向培养基中添加5 ng/ml FGF (GF003AF) (培养基中含有 FGF后可以在4°C 最多存贮一周, 避免反复冷热循环).
- 3D MSC扩增培养基: 向α-MEM (M4526)中添加10% FBS (ES-020-B), 1x 谷氨酰胺 (TMS-002), and 1x P/S 双抗(P4333). 在使用前，向培养基中添加50 ng/ml FGF (GF003AF) 和 50 ng/ml PDGF (P3201) (培养基中含有 FGF/PDGF后可以在4°C 最多存贮一周, 避免反复冷热循环).
- 脂肪生成分化培养基: 向DMEM (SLM021) 培养基中添加 20% FBS (ES-020-B), 1x 谷氨酰胺 (TMS-002), 1x P/S 双抗 (P4333), 10 µg/mL 胰岛素 (I2643), 0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(I5879), 0.1 mM 吲哚美辛 (I7378) 以及 1μM 地塞米松 (D4902).
- 成骨分化培养基: 向α-MEM (M4526) 培养基中添加10% FBS (ES-020-B), 1x 谷氨酰胺 (TMS-002), 1x P/S 双抗 (P4333), 50 μg/mL L-抗坏血酸 (A4403), 10 mM β-磷酸甘油 (G9422) and 100 ng/mL 骨形态发生蛋白2 (BMP-2) (SRP3326).
- Add 200 µl/well 人类脂肪MSC 细胞悬于3D扩增培养基中，以30,000 cells/well的细胞密度，200 µl/well的体积加入到TrueGel3D® HTS 水凝胶平板中。 注：细胞密度可根据特定的分析参数进行调整，例如培养天数。
- 每2-3天更换一次培养基。注意：使用透射光显微镜随时跟踪培养状态。细胞铺板后，HA-MSC会出现在水凝胶顶部，但在大约24小时内，它们将开始侵入水凝胶，水凝胶形成3D网络，如下一节所示。
- 为了诱导分化，将培养基更换为成骨或成脂肪分化培养基，并监测14-21天以上，每2-3天更换一次培养基。注：分化14-21天后，细胞将含有Oil-Red-O 阳性细胞（脂肪细胞）以及碱性磷酸酶ALP阳性细胞（骨细胞）
利用显微技术进行抗体鉴定检测
- 吸走培养基.
- 在室温下用4%甲醛溶液(1.00496)固定细胞.
- 用PBS (D8537) (200 µl/well)清洗三次，每次5-10 min. 注：可使用密封箔再次封闭板，并在4°C下储存，以备将来使用。
- 在室温下使用以下材料封闭2小时:
- 渗透性 封闭缓冲液(用于细胞内抗原): PBS (D8537) 中含有5% 驴血清 (D9663) 和 0.3% Triton X-100 (648463).
- 非渗透性封闭缓冲液(用于细胞外抗原): PBS (D8537) 中含有5% 驴血清。
- 在4°C条件下，用150µl/孔相应稀释的一抗在相应的封闭缓冲液中孵育过夜。例如：抗I型胶原（Col-I）抗体（AB745）或抗纤维连接蛋白（FN）抗体（F0916）可在非渗透性封闭缓冲液中以1:50稀释使用。
- 用PBS（D8537）(200 µl/well)清洗三次，每次5-10分钟。
- 在室温下，用200µl/孔的适当荧光标记二抗在同一封闭缓冲液中相应稀释，孵育2小时。例如：Atto 488抗兔IgG（62197）或Atto 594抗兔IgG（76085）可在非渗透性封闭缓冲液中以1:200稀释度使用。注：Hoechst 3358（94403）复染（PBS中1:500稀释）可与二级抗体一起添加，以复染细胞核（150µl/孔）。
- 用PBS（D8537）(200 µl/well)清洗三次，每次5-10分钟。
- 图像：通过配备20-30倍物镜的倒置荧光显微镜或共焦荧光显微镜，可以获得亮场和荧光图像，显示跨越水凝胶整个深度的图像信息。
分化骨髓间充质干细胞Oil-Red-O 和 碱性磷酸酶染色
脂肪细胞分化可以用Oil-Red-O (1.05230)染色分析. 骨细胞分化可以用 SIGMAFAST BCIP/NBT tablets (B5655) ALP染色分析. 培养7天后，从细胞培养孔中取出分化培养基，用PBS洗涤样品。然后添加BCIP/NBT。7分钟后，用磷酸盐缓冲盐水（D8537）清洗样品一次，并在室温下用4%多聚甲醛（PFA）（100496）固定水凝胶30分钟。最后，用PBS清洗样品一次，并在倒置显微镜下观察实验结果
图1。使用TrueGel3D®HTS水凝胶板扩增人骨髓间充质干细胞。使用共焦显微镜获得的TrueGel3D®HTS水凝胶板，对3D培养的第4天人类脂肪间充质干细胞进行荧光染色。间充质干细胞表达胶原、纤维连接蛋白，并显示复杂的三维形态。
图2. 使用TrueGel3D®HTS水凝胶板分化人骨髓间充质干细胞。使用共焦显微镜获得的TrueGel3D®HTS水凝胶板，对第14天培养的人脂肪间充质干细胞进行Oil-Red-O和ALP染色。
3D细胞培养优化的组织特异性脱细胞基质(dECM)水凝胶
细胞微环境会通过生物物理和生物化学途径，直接和间接地影响细胞行为。微环境由细胞外基质(ECM)蛋白、周围细胞、细胞因子、生长因子、激素和其他生物活性分子组成，具有张力和硬度等方面的纳米/微量级机械性能。传统的3D细胞培养依靠成分不明确的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤来源的基底膜(BME)提取物，比如Matrigel®基质(E1270)包裹细胞。这类水凝胶是由浓度较高的生长因子（TGFβ、EGF、IGF等）和ECM蛋白（层粘连蛋白、胶原蛋白、巢蛋白等）组成的异质性混合物，而且这些肿瘤来源的水凝胶不能完全再现天然组织微环境，可能会导致不一致且具有误导性的实验结果。最近，研究人员开始采用人工合成的水凝胶对细胞进行三维培养。然而，这些水凝胶通常缺乏生物复杂性和功能性，无法完全模拟3D培养所需的天然组织微环境。
脱细胞基质(dECM)支架
为了将某个组织的天然胞外基质与其中结合的细胞分离，需要进行脱细胞处理。获得的脱细胞基质(decellularized extracellular matrix, dECM)可用于细胞培养和组织工程应用。与其他肿瘤来源的基底膜提取物（比如Matrigel®基质）相比，这种dECM水凝胶支架提供的环境更加接近生理条件，细胞在其中的生长速度更高，而且没有任何外源生长因子。
图1. 组织脱细胞概览。脱去猪源器官（肝、肺、心等）中的细胞，溶解剩余的天然组织特异性ECM成分并冻存备用。这种dECM水凝胶可用于传统的2D ECM包被，也可用于包裹细胞进行3D细胞培养。
脱细胞基质(dECM)支架
为了将某个组织的天然胞外基质与其中结合的细胞分离，需要进行脱细胞处理。获得的脱细胞基质(decellularized extracellular matrix, dECM)可用于细胞培养和组织工程应用。与其他肿瘤来源的基底膜提取物（比如Matrigel®基质）相比，这种dECM水凝胶支架提供的环境更加接近生理条件，细胞在其中的生长速度更高，而且没有任何外源生长因子。
图1. 组织脱细胞概览。脱去猪源器官（肝、肺、心等）中的细胞，溶解剩余的天然组织特异性ECM成分并冻存备用。这种dECM水凝胶可用于传统的2D ECM包被，也可用于包裹细胞进行3D细胞培养。
我们的组织特异性dECM脱细胞基质水凝胶试剂盒是从多种健康猪器官（骨、心、肝、肾、肠、皮肤和肺）中提取出来的一系列天然脱细胞基质(dECM)。这种dECM水凝胶可用于传统的2D ECM包被，也可用于包裹细胞进行3D细胞培养，性能均高于同类水凝胶产品。
用于3D细胞培养的dECM肺水凝胶
图2. NHBE原代细胞培养。正常人支气管上皮(NHBE)原代细胞在dECM肺水凝胶或Matrigel®基质中培养10天。在dECM水凝胶中培养的NHBE细胞稳健表达正常肺上皮细胞标志物FOXJ1、KTR5、NKX2.1、panKT、p63和ZO-1(A,B,C)，生成的p63+人支气管上皮细胞亚群(D)比Matrigel®基质更多。
用于3D细胞培养的dECM肺水凝胶
图2. NHBE原代细胞培养。正常人支气管上皮(NHBE)原代细胞在dECM肺水凝胶或Matrigel®基质中培养10天。在dECM水凝胶中培养的NHBE细胞稳健表达正常肺上皮细胞标志物FOXJ1、KTR5、NKX2.1、panKT、p63和ZO-1(A,B,C)，生成的p63+人支气管上皮细胞亚群(D)比Matrigel®基质更多。
图3. NHBE原代细胞气液界面培养。正常人支气管上皮(NHBE)原代细胞气液界面培养(ALI)21天。在dECM肺水凝胶中培养的NHBE细胞形成组织性和复杂度更高的分层管腔结构，重现人呼吸道细胞结构，平均直径远超Matrige®基质。
图4. dECM肺水凝胶可用于模拟人肺癌。(A)将Jacket和A549肺腺癌细胞暴露于KPT-185、依托泊苷(etoposide)和tivantinib药物72小时，采用MTT检测法测定细胞数目。在dECM肺水凝胶中培养的细胞表现明显的耐药性，IC50值比Matrigel®基质更高，可能代表更具可预测性的生理反应。(B, C)Jacket和A549肺腺癌细胞在dECM肺水凝胶中培养24后，经过划痕和Boyden小室迁移检测证明迁移和侵袭性提高。(D)dECM肺水凝胶培养的Jacket和A549细胞的基因表达。在dECM肺水凝胶中培养的细胞表达的癌症相关基因水平（包括波形蛋白）比Matrigel®基质培养的更低。
用于3D细胞培养的dECM肝水凝胶
用于3D细胞培养的dECM骨水凝胶
图5. 人肝细胞原代培养。相比Matrigel®基质或I型胶原蛋白，在dECM肝水凝胶中培养的原代人肝细胞明显表达更多的LDL受体(A)，分泌更多的纤维蛋白原。相比Matrigel®基质或I型胶原蛋白，在dECM肝水凝胶中培养的原代人肝细胞明显形成更多的3D结构(C)，具有更高的细胞色素P450活性(D)，累积更多的糖原(E)。
图6. 原代人成骨细胞培养。原代人成骨细胞在dECM骨水凝胶(6 mg/mL)中培养1小时后，出现了特征性的树突形态。培养7天后，相比Matrigel®基质或I型胶原蛋白，在dECM骨水凝胶中培养的成骨细胞具有更高的碱性磷酸酶活性。
图7. 乳腺癌转移检测。采用dECM水凝胶构建乳腺癌骨转移模型，培养的乳腺癌亚型细胞对药物的反应异于塑料基质。(A)BT-549细胞和(B)T47-D细胞对药物（紫杉醇，5 µM）和溶剂对照(DMSO)处理48小时后的反应。
用于2D和3D细胞培养的dECM脱细胞基质水凝胶
| 货号 | 描述 |
| CC170 | dECM骨脱细胞基质水凝胶试剂盒 |
| CC171 | dECM心脏脱细胞基质水凝胶试剂盒 |
| CC172 | dECM肠道脱细胞基质水凝胶试剂盒 |
| CC173 | dECM肾脱细胞基质水凝胶试剂盒 |
| CC174 | dECM肝脱细胞基质水凝胶试剂盒 |
| CC175 | dECM肺脱细胞基质水凝胶试剂盒 |
| CC176 | dECM皮肤脱细胞基质水凝胶试剂盒 |
