染色体DNA的片段化
互联网
实验试剂
1. 细胞裂解液:10 mmol/L Tris-HCL(pH 8.0),150mmol/LNaCl,10mmol/LEDTA,0.4%SDS,蛋白酶K 100ug/m1。
2. RNase(10 mg/m1):RNase溶解于100 mmol/LTris-HCl(pH7.5)及15 mmol/L NaCl中。煮沸15 min后缓慢冷却至室温,-20℃储存。
3. TE缓冲液:Tris-HCl l0mmol/L(pH8.0),1 mmol/LEDTA(pH8.0)。
4. 其他试剂:醋酸钠(pH5.2,3mol/L)、饱和酚、异戊醇、氯仿、无水乙醇等。
实验步骤
1. 细胞收集:常规离心收集1-5X106 细胞,注意因凋亡而悬浮的细胞和贴壁的细胞要同时收集。弃上清液,PBS洗1次。加入0.5m1细胞裂解液,在50℃中放置3-5h,以裂解细胞。
2. 在细胞裂解液中加入等体积饱和苯酚抽提,6 000r/min离心5min吸取上清液,再依次用等体积酚:氯仿(1:1),氯仿:异戊醇(24:1)抽提,6 000r/min离心5min吸取上清液。
3. 加入2.5倍体积预冷的无水乙醇,1/10体积醋酸钠(3mol/L,pH=5.2),-20℃15min,12 000r/min离心30min。
4. 弃上清液,70%乙醇洗1次。沉淀晾干后溶于100/ul TE缓冲液。
5. 加5/ul RNase,37℃水浴30mid。取20ul DNA混合缓冲液后上样,1%琼脂糖凝胶电泳(50V,1.5~2h),UV下观察。