器材：

①培养皿、96 孔板

②显微镜

③低温离心机

④培养箱

⑤PCR 仪

⑥电转仪

⑦凝胶电泳仪

试剂：

①DH10B（recA）大肠埃希菌；pRpsl-neo 质粒或其他带有合适筛选标记的质粒；pSim18 质粒；相应的 BAC 克隆

②卡那霉素；氯霉素；潮霉素

小鼠染色体重组技术的主要操作步骤简述如下：

一、小鼠染色体重组载体的构建

（1）载体的构建

1）将含有相应 BAC 的 DH10B 在 37 ℃ 划线培养过夜，次日挑取单克隆在 20 μg／mL 的氯霉素浓度下 37 ℃ 振荡培养过夜。

2）将过夜培养菌液接种于 4 mL 新鲜氯霉素培养基，37 ℃ 振荡培养至 OD≈0.5～0.7。置于冰上冷却 30 分钟。5000 r／min、4 ℃ 离心 5 分钟，弃去上清。

3）用 2 mL pH7.0 的去离子水重悬沉淀，然后 4 ℃、5000 r／min 离心 5 分钟。重复此步骤 4 次。

4）重悬沉淀于 70 μl 去离子水，加入 10 ngpSim18 质粒轻轻混匀。转入干净的预冷 0.1 cm 电转杯。

5）在 1.75 kV，25 μF，200 Ω条件下电转，然后迅速加入到 SOC 或者 LB 培养基。32 ℃ 振荡培养 1 小时。

6）涂布含氯霉素（20 μg／mL）和潮霉素（100 μg／mL）双抗平板，32 ℃ 培养 24～48 小时。挑取单克隆，32 ℃ 振荡培养。

7）将 pRpsl-neo 质粒用 NheI 或者 EcoRV 酶切线性化，然后作为模板，通过嵌合引物（在引物两侧各加 60～80 bp 同源序列）扩增，获得两侧含有同源序列的 rpsl-neo 片段。

8）将培养含 BAC 和 pSim18 质粒的菌液接种新鲜培养基 32 ℃ 培养至 OD≈0.5～0.7，然后 42 ℃ 振荡培养 15 分钟，至于冰上 30 分钟，制作电转感受态，电转 rpsl-neo 片段（条件同上）。涂布于氯霉素和卡那霉素（15～25 μg／mL）平板，32 ℃ 培养 24～48 小时。

9）挑取单克隆于氯霉素和卡那霉素双抗性 LB 培养基中 32 ℃ 振荡培养过夜。挑取质粒 PCR 鉴定重组克隆，并用合适的限制性内切酶酶切鉴定。

（2）重组 BAC 载体的纯制备：在 E．coli 中扩增并挑取单菌落，BAC 质粒 DNA 操作可仿照标准分子生物学步骤。主要的不同是尽量使用宽口枪尖，避免涡旋和冻融 BAC DNA。建议使用 QIAGEN PlasmidMaxi 试剂提取 BAC。提取步骤可参见 QIAGEN Plasmid Maxi 试剂盒相关操作。

（3）制备显微注射线性化 BAC：

1）取 10～30 μg 的 BAC DNA，用 BssHII，NruI 或者 NotI 酶切，200 μl 体系，37 ℃ 孵育 3 小时。

2）用 200 mL 0.5xTBE 熔解 2 g 低熔点琼脂糖。在 15 cmx15 cm 的胶槽里倒胶。7 个点样孔，1 个略宽，6 个略窄（4 cm 宽）。在胶凝固后，将消化后的液体点在宽槽里。电泳 Marker 点在任一小槽中以准确估计 DNA 片段的大小，便于显微注射。在 0.5xTBE 缓冲液中跑胶，初始条件为 6 V／cm，最后转换时间分别为 1 秒和 10 秒，14 ℃，电泳 14 小时。

3）电泳后，切下其中一条泳道的胶条，用 EB 染色。染色 30 分钟后，在紫外光下标记线性化 BAC 条带的位置。将切下的胶条复位，切下未染色胶体部分的 BAC 对应区条带。

4）在含 100 nmol／L NaCl 的琼脂酶缓冲液中平衡胶条。

5）将胶体转移到一个微量离心管中，65 ℃ 下放置 10 分钟以融化胶，42 ℃ 水浴。每 200 μl 胶加 5 U 琼脂酶（5 μl）。42 ℃ 至少孵育 1 小时。冰上放置 2 分钟以凝固未被消化的琼脂糖。20000 g 离心 2 分钟以沉淀未被消化的琼脂糖。若可见明显的未被消化的琼脂糖，反复消化。

6）估计线性化片段的浓度，推荐荧光方法，琼脂糖电泳亦可。用含 100 nmol／L NaCl 的琼脂酶缓冲溶液稀释 DNA 至浓度为 3 ng／μl，4 ℃ 保存。据报道，不同浓度的 BACDNA 终浓度分别为 3 ng／μl、2 ng／μl 和 0.5 ng／μl，转基因效率或者转基因拷贝数没有明显差异。用于显微注射的，在含 100 mmol／L NaCl 的琼脂酶缓冲液中的线性化 BAC 至少能保存 5 天。

7）在电转胚胎干细胞或者显微注射受精卵前，用 1％ 的胶跑电泳以确保片段大小正确未破碎。

8）按照标准步骤电转胚胎干细胞或者进行受精卵显微注射。

二、染色体重组 ES 细胞的筛选

1. 经过 G418 筛选的阳性 ES 细胞克隆提取 DNA，用于 PCR 及其他后续分析。

2. 以阳性 ES 细胞基因组 DNA 为模板 PCR，分别扩增 BAC 转基因载体的 3＇及 5＇末端，正确扩增克隆用于后续分析。