小鼠骨髓的染色体制备

1. 实验原理　小鼠骨髓细胞有高度的分裂活性，并且数量非常多，因此不必进行体外培养，可直接观察到分裂期细胞。处于分裂期的细胞经秋水仙素处理，阻断纺锤丝的形成，使细胞分裂停止于中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态。低渗处理使细胞破裂，便于染色体分散。该方法在临床上多用于白血病的研究，也可用于观察毒性物质对机体遗传物质——染色体损伤的状况。 <o:p></o:p>

小鼠染色体2n=40,均为端着丝粒染色体, 雄性为40，XY，雌性为40，XX。 <o:p></o:p>

2. 实验试剂与器材　显微镜、恒温水浴锅、低速离心机、电子天平、解剖器械（搪瓷解剖盘、剪刀、镊子），注射器、针头、试管、试管架、滴管、载玻片。 <o:p></o:p>

0.85％生理盐水、固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1)、PBS(pH6.8)、Giemsa染液、秋水仙素(以100μg/ml的浓度溶于0.85％生理盐水中)、0.075mol/L KCl。 <o:p></o:p>

3. 实验方法与步骤 <o:p></o:p>

（1）秋水仙素处理：取骨髓前3h先给小鼠腹腔注入秋水仙素，注射剂量为100μg／kg动物体重。 <o:p></o:p>

（2）取骨髓：用损伤脊髓法处死小鼠，然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉，取出大腿骨，用一小块纱布搓干净附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨两端膨大的关节头，然后用注射器吸取5ml 0.85％生理盐水，插入股骨一端，将骨髓细胞冲洗至10ml的离心管中。可重复冲洗多次，直至骨髓腔呈白色为止。 <o:p></o:p>

（3）低渗处理：将所获得的细胞悬浮液以 1000rpm离心10min，吸去上清液，留0.2ml沉淀物，加0.075mol/L KCL 溶液（ <st1:chmetcnv> <span>37</span>℃ </st1:chmetcnv>）至8ml刻度，将细胞沉淀物吹散打匀，在 <st1:chmetcnv> <span>37</span>℃ </st1:chmetcnv>水浴低渗25min。 <o:p></o:p>

（4）固定：低渗处理后，立即加入1ml新配制且预冷的固定液，抽打均匀，然后1000 rpm离心10min，弃上清。沿管壁加固定液至6ml， 吹散细胞后静止固定10min，即第一次固定。按上述条件离心，去上清液，再次加入固定液至6ml，进行第二次固定。10min后离心吸去上清液，留0.2ml沉淀物，再往沉淀物中滴加4滴固定液，冲匀制成细胞悬液。 <o:p></o:p>

（5）滴片：取事先在冰箱中预冷的载玻片，从约 <st1:chmetcnv> <span>15cm</span> </st1:chmetcnv>高处向每个载玻片上滴1～2滴细胞悬液于粘有冰水的载玻片上，晾干。 <o:p></o:p>

（6）染色：取制片平放在玻璃板上，用1∶9 Giemsa染液染色20min，流水冲洗后晾干。 <o:p></o:p>

（7）观察：小白鼠染色体的形态特征，并计算2n的染色体数目。