染色体制备

一、 人外周血染色体制备

1. 实验原理　人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead 提出来的。正常情况下，人外周血小淋巴细胞都处在G1期（或G0期），但在体外给予一定的条件，进行培养，经72 h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。

在培养液中加入植物血凝素（PHA），淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，可抑制细胞分裂时纺锤丝的形成，使细胞分裂停止在中期，同时它可改变细胞质的黏度，引起染色体在细胞质中分散。经低渗和固定，即可得到大量的、分散效果好的染色体分裂象。人体的1ml外周血中一般含有约（1～3）×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。本节介绍人外周血淋巴细胞的悬浮培养法，以及染色体标本的制备。

2. 试剂与器材

（1）2ml注射器、培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20min。离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。

（2）超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。

（3）试剂：

① 培养基的配制：

RPMI 1640培养基 4ml

小牛血清 1ml

青霉素和链霉素 各100IU/ml

PHA 0.2ml

肝素 1小滴

以5% NaHCO3调pH至7.2～7.4, 4℃备用。

② 肝素：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2%，灭菌。

③ 秋水仙素：生理盐水配制成20μg/ml浓度，灭菌，分装，置－20℃。

④ 低渗液：0.075mol/L KCl。

⑤ 固定液： 甲醇∶冰乙酸（3∶1），临时配制。

⑥ Giemsa工作液：1份原液和９份磷酸缓冲液，临时配制。

⑦ 磷酸缓冲液：1/15mol/L Na2HPO4、1/15mol/L KH2PO4等体积混合。

⑧ 5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。

3. 实验步骤

（1）接种，培养。

① 在无菌条件下，用灭菌注射器吸取0.2%肝素液（生理盐水配制，灭菌）0.2ml，湿润针筒后，采静脉血1～2ml、转动注射器使血液与肝素充分混匀。

② 无菌条件下，将肝素化血液滴入至外周血培养基内，每5ml培养液内滴入血滴28～30滴（7号针头）轻轻混匀。

③ 置37℃恒温箱内，静止培养68～72h。注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象，可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养。

④ 终止培养前2～3h，加入浓度为20μg/ml的秋水仙素，每5ml培养基中用7号针头，加3～4滴使最终浓度为0.1μg/ml。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2～3h，以积累较多停止在中期的分裂象。

（2）制片。

① 收获细胞：由恒温箱取出培养瓶，用吸管充分吹打培养瓶瓶壁，使细胞全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形离心管内，1500转/min，离心10min，去上清液。

② 低渗处理：加入37℃预温的0.075mol/L KCl 8ml，反复吹打（约一百次）后，置37℃水浴箱中低渗处理25min左右。

③ 预固定：加入新鲜制备固定液1ml（甲醇∶冰醋酸=3∶1），轻轻混匀。

④ 离心：2000转/min，离心10min，吸弃上清液。

⑤ 固定：沿离心管壁慢慢加入固定液8ml，轻轻混匀，固定10min。

⑥ 离心：同上，吸去上清液。

⑦ 再固定：加固定液8ml，混匀，固定10min。

⑧ 离心：同上，吸去上清液。

⑨ 制细胞悬液：根据细胞量多少，加入适量固定液，充分混匀，制成细胞悬液。

⑩ 滴片：取出预先经冰水浸泡的载玻片，用吸管吸取混匀的细胞悬液在离冰片约30cm距离进行滴片，每片约滴2～3滴细胞悬液，使细胞较好分散。一般每一培养瓶可制3～5张标本片。

{11} 染色：标本晾干后，即可用染液（Giemsa液原液1份，pH6.8的磷酸缓冲液9份）染色15min，自来水冲洗后（从背面冲洗）晾干。

（3）镜检：人类每个体细胞有46条染色体，根据染色体的长度和着丝粒位置的不同，可以分成22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。

二、体外培养细胞的染色体标本制备

1． 体外培养的细胞，在倒置镜下观察到有较多的分裂细胞（传代后24h，圆形发亮的细胞）时，加入秋水仙素溶液，终浓度为0.3μg/ml培养液；

2． 继续培养3h；

3． 胰酶消化收集细胞至离心管；

4． 离心1000转/min，离心10min，去上清；

5． Hanks液洗，离心，去上清；

6． 低渗处理：加入0.075mol/L KCl溶液8ml，置37℃恒温水浴中30min，用吸管稍吹打（同上）；

7． 固定及制片如外周血染色体的制备。

三、注意事项

1． 秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长,故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。

2． 固定液应在使用前临时配制。

3． 载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。

4． 染色体分裂指数低：患者处于非常时期（放、化疗期）；培养基营养成分不良；培养基pH偏低或偏高；PHA过量或不足；小牛血清质量不高；培养箱温度偏低；秋水仙素处理时间过短。

5．接种的血样愈新鲜愈好。

6. 培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。

附：

Carnoy固定液：

固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。

Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。

低渗液（hypotonic solution）

低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。

低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。

实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。

Giemsa染液

Giemsa原液配制：称Giemsa粉末0.5g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。56℃中保温90～120min。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。使用时按要求用PBS稀释，一般稀释10倍。