染色体标本制备实验

染色体是真核细胞有丝分裂过程中出现的可见结构，只有获得染色体标本才能进行核型分析，检测真核细胞是否出现了染色体数目异常或者结构畸变。

染色体标本制备实验的基本原理是人类染色体标本制备的取材主要为外周血白细胞，皮肤组织，绒毛细胞，羊水细胞，骨髓等。通常情况下，可采取少量外周静脉血、绒毛或羊水细胞，做短期培养以获得足够数量的分裂期细胞，经秋水仙素（colchicine）处理解聚微管形成的纺锤丝，使正在分裂的细胞停止在分裂中期，再经低渗、固定等处理，得到较多的中期染色体以供分析。

耗材与仪器：

酒精灯、采血器材、培养瓶、超净工作台

恒温培养箱、恒温水浴箱、10 mL 刻度离心管、乳头吸管、低速离心机

4 ℃ 预冷处理的载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、人外周静脉血

绒毛细胞、羊水细胞

试剂：

RPMI-1640 液体培养基、HamF10 培养液、

小牛血清、肝素（500 U/mL）

植物血凝素（PHA）

秋水仙素（10 μg/mL）

0.075 mol/L KCl 低渗液、0.4％ KCl

0.4％ 柠檬酸钠、70％ 乙酸

0.85％ 生理盐水

固定液（3 份甲醇 : 1 份冰醋酸，现用现配）

吉姆萨（Giemsa）原液、香柏油、二甲苯

染色体标本制备实验的基本过程可分为如下几步：

一、外周静脉血培养（半微量法）及染色体标本制备

1、在酒精灯外焰上，用一次性注射器抽取肝素溶液约 0.2 mL，将注射器的消毒纸套套上针头，抽动针筒，使肝素湿润至针筒 5 mL 刻度处，然后将剩余的肝素排出。

2、常规消毒后，采集肘外周静脉血约 5 mL，抽动注射器使血液与肝素混匀。

3、在超净工作台中，将 RPMI-1640 液体培养基（8 mL）、小牛血清（2 mL）、植物血凝素（0.7 mL）依次加入消毒好的小培养瓶中，然后向每个培养瓶中滴加 30 滴全血，水平晃动混匀。

4、将小培养瓶置 37 ℃ 恒温培养箱中水平静置培养 70 h（培养 24 h 后，轻轻晃动培养瓶，使血细胞均匀悬浮，再继续培养）。

5、加入秋水仙素，使其终浓度达到 0.2 μg/mL 培养基。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素在培养基中混合均匀，继续静置培养至 72 h。同时将 0.075 mol/L KCl 低渗液置于 37 ℃ 恒温水浴箱中预温。

6、中止培养，去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，反复冲洗瓶壁，使贴壁细胞脱离瓶壁，然后将全部培养液吸入 10 mL 刻度离心管中。

7、配平，1000 r/min 离心 6~8 min。

8、弃掉上清液，加入 37 ℃ 预温的 0.075 mol/L KCl 低渗液 9 mL，用吸管轻轻吹散细胞团，混匀后置 37 ℃ 恒温水浴箱低渗处理 10~15 min。

9、加入 1 mL 新配制的固定液（3 份甲醇 : 1 份冰醋酸），轻轻混合均匀，1000 r/min 离心 6 min。

10、弃掉上清液，加入 10 mL 新配制的固定液（3 份甲醇 : 1 份冰醋酸），轻轻吹散细胞团制成细胞悬液后，室温下固定 30 min。

11、1500 r/min 离心 6 min。

12、弃掉上清液，重复固定一次。

13、弃掉上清液，根据细胞数量的多少加入数滴新配制的固定剂，轻轻吹散细胞制成悬液。

14、吸取少量细胞悬液，于 20 cm 左右高度滴 2~3 滴于 4 ℃ 预冷处理的载玻片上，吹散，空气干燥。

15、取 3 滴吉姆萨原液加 10 滴磷酸盐缓冲液（pH 6.8），混匀后滴在玻片标本上，染色 6 min。

16、流水轻轻冲洗玻片，将染液冲掉，空气干燥。

17、先用低倍镜浏览整张染色体玻片标本，再分别在高倍镜和油镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。

二、绒毛细胞染色体标本的制作方法（改良法）

1、经宫颈进入宫腔，吸取大约 5 mL 左右的绒毛。

2、将所吸取的绒毛，用 0.85％ 生理盐水反复冲洗，去除血污。

3、将绒毛置于盛有 5 mL 无血清的 RPMI-1640 培养液的离心管中，加入秋水仙素（使终浓度为 1 μg/mL 培养基），混匀后置 37 ℃ 温箱内孵育 18~20 min。

4、向离心管中加入 0.4％ KCl 和 0.4％ 柠檬酸钠等量混合的低渗液 8 mL ，置 37 ℃ 低渗 10~12 min。

5、加入 2 ml 新配制的固定液（3 份甲醇 : 1 份冰醋酸），室温固定 3 min。

6、尽量吸尽所有液体，加入 70％ 乙酸 1 mL，静置解离细胞 1~2 min 后，立即加入 2 mL 甲醇、混匀。

7、缓慢加入 5 mL 新配制的固定液，混匀后置室温下继续固定 30 min。

8、1200 r/min 离心 8 min，弃掉上清液，再加入 5 mL 新配制的固定液，重复固定 30 min。

9、用吸管轻轻吹吸细胞悬液，挑去绒毛支架。1200 r/min 离心 8 min。

10、弃掉上清液，加数滴新配制的固定液，制成细胞悬液后，滴片。

11、以后的染色镜检步骤同 1。

三、羊水细胞的培养及染色体标本制备

1、无菌吸取 10 mL 羊水，置于 10 mL 离心管中，1200 r/min 离心 5 min。

2、弃掉上清液，保留 0.5 mL 羊水／细胞层，用吸管吹打均匀，接种于 5 mL HamF10 培养液中，置 37 ℃ 温箱中培养 5~7 d。

3、培养终止前 4 h，加入秋水仙素，使终浓度为 0.25 μg/mL，继续培养。

4、用吸管吸取培养液反复冲洗瓶壁，使贴壁细胞充分脱落，然后将细胞悬液吸至离心管中。

5、1200 r/min 离心 8 min，弃掉上清液。

6、加入 37 ℃ 预温的 0.4％ KCl 和 0.4％ 柠檬酸钠等量混合的低渗液 3~4 滴，混匀后继续加低渗液至 1 mL，37 ℃ 孵育 5 min。

7、加新配制的固定液（3 份甲醇 : 1 份冰醋酸）数滴，轻轻混匀作预固定。

8、1200 r/min 离心 8 min，弃掉上清液。

9、加 4 mL 新配制的固定液，室温固定 40 min。

10、1200 r/min 离心 8 min，弃掉上清液。

11、用 2 mL 新配制的固定液重复固定一次。

12、1000 r/min 离心 10 min，弃掉上清液。

13、加新配制的固定液 2~3 滴，制成细胞悬液后滴片。

14、以后染色镜检步骤同 1。

1. 采血接种培养时，要注意肝素的用量，肝素过多可能导致溶血和抑制淋巴细胞的转化与分裂；肝素太少可能发生凝血或培养物出现纤维蛋白形成的膜状结构（该膜状物可在无菌条件下去除）。

2. 半微量培养方法中接种的是全血，所含红细胞较多，容易出现红细胞凝聚现象，接种培养 24 h 后，必须轻轻摇动培养瓶使细胞散开，以免影响培养效果。

3. 对于染色体标本制备来说，影响标本质量最关键的因素是秋水仙素作用的量和时间以及低渗的处理时间。

外周血淋巴细胞培养中，其分裂高峰在 70~72 h，所以加秋水仙素的时间可在培养的 68~70 h 左右，终浓度为 0.2 μg/mL。

如果秋水仙素质量有问题或秋水仙素的浓度过低、处理时间不够或处理不合适，结果分裂相少；如果秋水仙素浓度过高或处理时间过长，则使染色体过于缩短，难以进行核型分析。

对于低渗时间来说，如果处理时间过长，细胞膜往往过早破裂，导致分裂细胞丢失或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。

4. 固定液必须现用现配。

5. 载玻片必须事先经过去油处理，制片前应保存在 4 ℃ 或冰水混合物预冷。