染色体提前凝集标本的制备

染色体提前凝集标本的制备原理是将 M 期细胞和 G1 期细胞融合，则 G1 期细胞染色质就凝集为光学显微镜下可见的单股细而长的提前凝集染色体，即 G1-PCC。其染色体的长短和粗细与细胞在 G1 期所处的位置紧密相关：早 G1 期的染色体短而粗，晚 G1 期则细而长。S 期细胞正处于 DNA 复制阶段，大量的复制单位不同时启动复制，所以正在复制的染色质高度解螺旋，光学显微镜下不可见，而只能看到尚未进行复制或复制后又重新凝集的部分。M 期细胞诱导 S 期细胞的染色质凝集呈粉末状或粉碎颗粒状，在电镜下可见：颗粒状是染色质螺旋化程度高的部位，颗粒之间由纤细的染色质丝相连，并且可根据颗粒是单股或双股区分出是复制前还是复制后的染色质，从而断定细胞是处于早 S 期还是晚 S 期。G2-PCC 的形态已接近于 M 期的染色体，只是螺旋化程度较低，所以其染色浅、细长、姐妹染色单体之间紧靠一起。

染色体提前凝集标本常用于细胞周期分析、正常细胞和肿瘤细胞染色体的微细结构的研究、多种因素作用致染色体损伤及修复效应的研究、血液病的诊断及预后等临床实践方面。

器材:

① 普通光学显微镜

② 普通低速离心机

③ CO₂ 恒温培养箱

④ 超净工作台

⑤ 5 ml 刻度离心管、一次性滴管、载玻片、盖玻片、细胞计数板试剂

② PEG(M, = 4000)(50%)

③ RPMI-1640 培养液

④ 小牛血清

⑤ Hanks 液

⑥ 秋水仙素(10 μg/ml)

⑦ 胰蛋白酶(0.25%)

⑧ KC1(0.075 mol/L)

⑨ 甲醇-冰醋酸(3:1)(新鲜配制)

⑩ 吉姆萨染液

染色体提前凝集标本的制备基本过程可分为如下几步:

(1)按一般方法传代细胞。

(2)在培养 2~3 d、细胞生长旺盛并处于对数生长期时，加入秋水仙素（终浓度为 0.2~0.5 μg/ml），继续在 CO₂ 恒温培养箱中培养 3~4 h。

(3)轻轻倾去培养液，用 5 ml Hanks 液清洗细胞 2 次，弃去死细胞、细胞碎片和 Hanks 液。

在上述收集过 M 期细胞的贴壁细胞中，加入终浓度为 0.25% 的胰蛋白酶溶液，消化 2~3 min，弃去消化液,加入 5 ml Hanks 液，用吸管反复吹打细胞层，把细胞悬液转移入 5 ml 刻度离心管中，计数备用。

(1)将 M 期细胞和间期细胞按 1:1 比例（各约 106 个）混合于 5 ml 离心管中，800 g 离心 5 min，弃上清液。用 5 ml Hanks 液重悬洗涤、离心 2 次，尽可能地弃尽上清液。

(2)轻弹管底使沉淀松动，置 37℃（39 ℃ 左右更佳）水浴中预温，缓慢逐滴加入 0.5~1 ml 37 ℃ 预温的 50% PEG 溶液，边加边用吸管轻轻混匀（也可在滴加过程中先轻摇混匀最后再用吸管轻轻吹打混匀）。37 ℃ 静置 1 min。

(3)加入 5 ml 无血清的 RPMI-1640 培养液（开始 1 ml 应缓慢逐滴加入），混匀（稀释以终止 PEG 溶液的作用）。800 g 离心 5 min（离心前可在 37 ℃ 静置 5~10 min），弃上清液。

(4)加入含小牛血清的 RPMI-1640 生长培养液，轻轻吹打混匀使细胞悬浮。37 ℃、5% CO₂ 培养 30~60 min.

将上述细胞取出，800 g 离心 8 min，弃上清液。按常规方法制备染色体标本。经吉姆萨染液染色后观察结果。

(1)为了保证融合率，加 PEG 之前应尽可能地弃尽上清液；在滴加 50%PEG 时，应缓慢、逐滴加入，滴加过程注意要温和混匀。

(2)在加完 PEG 并静置 1 min 后，用培养液稀释 10 倍，手法要轻。在 37 ℃ 培养较长时间(30~60 min)，一般可获得高比例的 PCC。