应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本
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【实验目的】
通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。
【实验用品】
一、材料 人宫颈癌上皮细胞(HeLa细胞)
二、器材和 仪器 显微镜、离心机、水浴箱、热吹风机、10ml刻度离心管、5(1/2) 针头注射器、试管架、染色槽、废液缸、吸水纸、擦镜纸、冰冻载玻片、香柏油瓶、记号笔、酒精灯。
三、 试剂 50％PEG、Hanks液(pH7.4)、RPMI一1640培养基(含10％灭活小牛血清，pH7.4)10μg／ml秋水仙素，0.075mol／L KCl低渗液、2％柠檬酸钠溶液、0.2％次甲基兰染液、1／15mol／L PBS、Carnoy固定液、Giemsa染液。
【实验内容】
一、原理
如实验十一所述，两个或两个以上的同种或不同种细胞可以在诱导物的作用下融合成一个细胞。
七十年代初，由于发现M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染色体称提前凝集的染色体(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。这项技术已应用于细胞周期分析、正常细胞和肿瘤细胞染色体的微细结构的研究、多种因素作用细胞使染色体损伤及修复效应的研究，预测某种血液病的病程、愈后及复发的临床实践等方面。
二、方法
1．收集培养的M期HeLa细胞 取一瓶处于对数生长期的HeLa细胞，向培养基中加入10μg／ml的秋水仙素使终浓度为0.04μg／ml，在37℃二氧化碳培养箱内继续培养12小时，使大量生长的细胞被阻断于M期。每组取一瓶经上述处理的细胞，以平行于细胞生长面方向反复振摇，使培养液不断冲涮细胞层(或用吸管吹打)，M期细胞因变成球形容易脱离瓶壁而悬浮。将含有M期细胞的培养基移入 离心管 中，1000rpm离心5分钟，弃去上清加人5ml Hanks液，用吸管吹打成细胞悬液。
2．收集培养的HeLa细胞 取一瓶生长良好的HeLa细胞，弃去培养基。加入少量0.25％的胰蛋白酶消化2～3分钟，弃去胰酶消化液。然后加入5ml Hanks液。用吸管吹打成单个悬浮细胞备用。
3．50％PEG的制备
称取0.5g PEG(MW4,000)，倒入 离心管 中，在酒精灯上加热使之融化(约为0.5ml)，再加入预热的Hanks液0.5ml混匀，放在37℃ 水浴 中待用。
4.细胞融合
(1)将上述l、2两管细胞倒入一个离心管中充分混匀。1000rpm离心5分钟，去掉上清，再小心地吸尽残液。
(2)用指弹法弹散细胞，在37℃ 水浴 条件下吸取0.5ml 50％PEG，逐滴加入离心管内，并不断地轻轻摇动，整个过程约90秒钟。然后迅速加入5ml Hanks液以终止PEG的作用。在37℃水浴甲静置5分钟。
(3)1000rpm离心5分钟。弃去上清，加入2ml有 血清 的RPMI一1640培养基，同时用针头的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，轻轻吹打成悬液，37℃水浴中温育
30~60分钟。
5．制备PCC标本
细胞温育后，1000rpm离心5分钟弃去上清，加入10ml 0.075mol／L KCl低渗液轻轻制成悬液。在37℃处理25分钟左右；终止时加入lml Carnoy固定液进行固定，1000rpm离心8分钟，去掉上清，指弹 离心管 底部使细胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30分钟，1000rpm离心5分钟，弃去上清留0.2ml，用 吸管 轻轻吹打成悬液，取预冷的载玻片滴一张片，烤干后，Giemsa染色15分钟左右，水冲洗，干燥后镜检。
三、结果观察
在低倍镜下，可以容易地找到M期与I期细胞融合而诱导产生的PCC图像，由于处于I期不同时相的细胞均能与M期细胞融合而被诱导产生PCC，因此有三种不同形态特点的提前凝集染色体：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。其形态特点分别是：
G1期PCC为单线染色体，细长，着色浅呈蓬松的线团状；S期PCC由于染色体解旋， DNA以多点进行复制，复制后的部分着色较深，以双线染色体片段形式存在，故呈粉碎颖粒状结构；G2期PCC因DNA复制完毕，所以可见凝集的双线染色体，但较M期染色体细长。
根据上述I期各时期PCC特点。在自己制备的标本中观察并分析各期PCC的图像。
通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。
【实验用品】
一、材料 人宫颈癌上皮细胞(HeLa细胞)
二、器材和 仪器 显微镜、离心机、水浴箱、热吹风机、10ml刻度离心管、5(1/2) 针头注射器、试管架、染色槽、废液缸、吸水纸、擦镜纸、冰冻载玻片、香柏油瓶、记号笔、酒精灯。
三、 试剂 50％PEG、Hanks液(pH7.4)、RPMI一1640培养基(含10％灭活小牛血清，pH7.4)10μg／ml秋水仙素，0.075mol／L KCl低渗液、2％柠檬酸钠溶液、0.2％次甲基兰染液、1／15mol／L PBS、Carnoy固定液、Giemsa染液。
【实验内容】
一、原理
如实验十一所述，两个或两个以上的同种或不同种细胞可以在诱导物的作用下融合成一个细胞。
七十年代初，由于发现M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染色体称提前凝集的染色体(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。这项技术已应用于细胞周期分析、正常细胞和肿瘤细胞染色体的微细结构的研究、多种因素作用细胞使染色体损伤及修复效应的研究，预测某种血液病的病程、愈后及复发的临床实践等方面。
二、方法
1．收集培养的M期HeLa细胞 取一瓶处于对数生长期的HeLa细胞，向培养基中加入10μg／ml的秋水仙素使终浓度为0.04μg／ml，在37℃二氧化碳培养箱内继续培养12小时，使大量生长的细胞被阻断于M期。每组取一瓶经上述处理的细胞，以平行于细胞生长面方向反复振摇，使培养液不断冲涮细胞层(或用吸管吹打)，M期细胞因变成球形容易脱离瓶壁而悬浮。将含有M期细胞的培养基移入 离心管 中，1000rpm离心5分钟，弃去上清加人5ml Hanks液，用吸管吹打成细胞悬液。
2．收集培养的HeLa细胞 取一瓶生长良好的HeLa细胞，弃去培养基。加入少量0.25％的胰蛋白酶消化2～3分钟，弃去胰酶消化液。然后加入5ml Hanks液。用吸管吹打成单个悬浮细胞备用。
3．50％PEG的制备
称取0.5g PEG(MW4,000)，倒入 离心管 中，在酒精灯上加热使之融化(约为0.5ml)，再加入预热的Hanks液0.5ml混匀，放在37℃ 水浴 中待用。
4.细胞融合
(1)将上述l、2两管细胞倒入一个离心管中充分混匀。1000rpm离心5分钟，去掉上清，再小心地吸尽残液。
(2)用指弹法弹散细胞，在37℃ 水浴 条件下吸取0.5ml 50％PEG，逐滴加入离心管内，并不断地轻轻摇动，整个过程约90秒钟。然后迅速加入5ml Hanks液以终止PEG的作用。在37℃水浴甲静置5分钟。
(3)1000rpm离心5分钟。弃去上清，加入2ml有 血清 的RPMI一1640培养基，同时用针头的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，轻轻吹打成悬液，37℃水浴中温育
30~60分钟。
5．制备PCC标本
细胞温育后，1000rpm离心5分钟弃去上清，加入10ml 0.075mol／L KCl低渗液轻轻制成悬液。在37℃处理25分钟左右；终止时加入lml Carnoy固定液进行固定，1000rpm离心8分钟，去掉上清，指弹 离心管 底部使细胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30分钟，1000rpm离心5分钟，弃去上清留0.2ml，用 吸管 轻轻吹打成悬液，取预冷的载玻片滴一张片，烤干后，Giemsa染色15分钟左右，水冲洗，干燥后镜检。
三、结果观察
在低倍镜下，可以容易地找到M期与I期细胞融合而诱导产生的PCC图像，由于处于I期不同时相的细胞均能与M期细胞融合而被诱导产生PCC，因此有三种不同形态特点的提前凝集染色体：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。其形态特点分别是：
G1期PCC为单线染色体，细长，着色浅呈蓬松的线团状；S期PCC由于染色体解旋， DNA以多点进行复制，复制后的部分着色较深，以双线染色体片段形式存在，故呈粉碎颖粒状结构；G2期PCC因DNA复制完毕，所以可见凝集的双线染色体，但较M期染色体细长。
根据上述I期各时期PCC特点。在自己制备的标本中观察并分析各期PCC的图像。
