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染色体DNA的提取

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2435

<font>一、实验目的与原理<br /> DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象。DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织,通过裂解液裂解细胞,有机溶剂反复抽提,使DNA进入水相与蛋白质成分分开,在RNase作用下,降解RNA以纯化DNA。<br /> 二、材料以方法<br /> 1、 材料:培养菌体<br /> 2、 仪器设备:超净工作台,培养箱,摇床,恒温水浴锅,高速冷冻离心机,台式离心机,移液枪一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪<br /> 3、 试剂:<br /> 细胞裂解液 100 mM Tris-HCl<br /> 5 mM EDTA<br /> 500 mM NaCl<br /> 1.25% SDS<br /> PH 7.5<br /> 饱和酚,氯仿/异戊醇,酚/氯仿/异戊醇<br /> 无水乙醇,70%乙醇,异丙醇<br /> 3 M NaAc pH5.2, RNase,50×TE缓冲液,电泳载样缓冲液<br /> 三、操作步骤<br /> (1) 培养菌体<br /> (2) 加入10 ml裂解液,1/10体积酚,于65℃下20-30 min,然后加入等体积的氯仿,轻摇<br /> (3) 12000-15000rpm离心15 min<br /> (4) 取上�液,加入等体积氯仿,轻摇,12000-15000rpm离心15 min<br /> (5) 取上�液,加入0.6倍体积冷异丙醇(-20℃)或2倍体积冷无水乙醇(-20℃)<br /> (6) 加入1/10体积的3 M NaAc(pH5.2),置于室温下10 min<br /> (7) 12000-15000rpm离心10 min<br /> (8) 倒弃液体留下沉淀,用70%乙醇洗涤沉淀<br /> (9) 加入2倍体积无水乙醇<br /> (10) 12000-15000rpm离心10 min<br /> (11) 倒弃液体留下沉淀,真空干燥<br /> (12) 复溶于2 ml TE<br /> (13) 加入RNase,65℃或37℃处理10-30 min<br /> (14) 加等体积酚,酚/氯仿,氯仿各一次,12000-15000rpm离心10 min<br /> (15) 取上�液,加入0.6倍体积冷异丙醇(-20℃)或2倍体积冷无水乙醇(-20℃)<br /> (16) 加入1/10体积的3 M NaAc(PH5.2),置于室温下10 min<br /> (17) 12000-15000rpm离心10 min<br /> (18) 倒弃液体留下沉淀,用70%乙醇洗涤沉淀<br /> (19) 真空干燥沉淀<br /> (20) 复溶于0.5-1.0 ml的TE或水中,分装成小体积,4℃或-20℃保存。<br /> (21) 电泳检测提取DNA的质量<br /> 四、结果与分析<br /> 点样空,若发亮则说明有污染<br /> 超螺旋结构DNA,若条带有拖尾则<br /> 说明有破碎的DNA<br /> 少量未清除的RNA<br /> 五、注意事项<br /> 1、 重点防止DNA的损伤,包括各种物理、化学和机械损伤。<br /> 2、 干燥好的染色体DNA最好溶于去离子水,以备后面直接利用。如果用TE 缓冲液溶解,后面还需去离子。<br /> 3、 取上清时,如果上清液过少,可再加入少量水,重新离心,取上清,避免DNA损失过多。<br /> </font>

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