染色体畸变试验

染色体畸变是指染色体结构和数目的异常变化及其所导致的遗传性状的变异，包括染色体结构变异和染色体数目变异。其特点是在显微镜下可见其变异。

染色体畸变试验的基本原理是染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期 G 期和 S 期时，诱发染色体型畸变，而作用于 G2 期时则诱发染色体单体型畸变。给试验的大、小鼠腹腔注入秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，以便增加中期分裂象细胞的比例，并使染色体丝缩短、分散，轮廓清晰。在显微镜下观察染色体数目和形态。

器材：

恒温水浴锅 37 ℃ ± 5 ℃、离心机、生物显微镜、解剖剪、镊子、止血钳、1 ml 注射器、载玻片、盖玻片（24 mm x 50 mm）、塑料吸瓶、纱布、滤纸等

试剂：

① 0.1% 秋水仙素

② 2.2% 柠檬酸钠

③ 1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液（磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）9.47 g 溶于 1000 ml 蒸馏水中；1/15 mol/L 磷酸）

④ 1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液（磷酸二氢钾（KH₂PO₄）49.07 g 溶于 1000 ml 蒸馏水中；将磷酸氢二钠溶液 80 ml 与磷酸二氢钾溶液 20 ml 混合，用 pH 计测定并调节 pH 至 7.4）

⑤ 0.075 mol/L 氯化钾溶液

⑥ 甲醇（分析纯）： 冰乙酸（分析纯）以 3:1 混合，临用时现配

⑦ 吉姆萨溶液分储备液和应用液配制（吉姆萨储备液：取吉姆萨染料 3.8 g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨，逐渐加甲醇至 375 ml。溶解后再加 125 ml 纯甘油，于 37 ℃ 温箱保温 48 小时，在此期间摇动数次，放置 1~2 周过滤备用；吉姆萨应用液：取 1 ml 储备液加入 10 ml pH 7.4 的磷酸缓冲液。）

染色体畸变试验的基本过程可分为如下几步：

1、口腔材料配制

一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳浊液或悬浊液。受试物应于灌胃操作前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等）保存具有稳定性。

2、实验动物的处理

经静脉给予受试物或材料浸提液 3 次，每次间隔 24 小时，在末次给受试物后 18~24 小时取材。必要时可先用一个剂量的 3 只动物，于给受试物后 6 小时、24 小时、48 小时分别处死动物取材，以选择处死动物的最适时间。在一次给受试物时也可每个剂量组用 15 只动物，于 6 小时、24 小时、48 小时后分别各处死 5 只动物取材。处死动物前 2~4 小时，按 40 mg/kg 腹腔注入秋水仙素。大鼠、小鼠颈椎脱臼处死。

3、标本制备

① 取材。取股骨，去附着的肌肉，剪去两端骨骺，用带针头的注射器吸取 2~4 ml 2.2% 柠檬酸钠溶液，将骨髓洗入 10 ml 离心管中，反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色。

② 然后以 1000~1500 r/min 离心 10 分钟，弃去上清液。

4、制片

① 离心后的沉淀物加入 4 ml 0.075 mol/L 氯化钾溶液，混匀后在 37 ℃ 水浴或恒温箱中放置 10~20 分钟，再以 1000~1500 r/min 离心，弃去上清液。

② 将新配制的甲醇-冰乙酸固定液 4 ml 沿管壁加入受试物中，10~15 分钟后，用吸管将细胞团块打碎继续固定 10~15 分钟，以 1000 r/min 离心 10 分钟弃去上清液，再加固定液 4 ml 静置 20 分钟后离心，弃去上清液，用吸管混匀制成 0.5~1.0 ml 细胞悬液。

③ 先将洗净的载玻片保存于水中备用。自来水中取出载玻片，倾斜 30° 放置，立即吸取细胞悬液在玻片的 1/3 处滴 3 滴，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个标本制 2~3 张玻片，空气中自然干燥。临用时取吉姆萨储备液 1 ml，磷酸盐缓冲液 10 ml，置染色缸中，将涂片浸于染液中染色 15 分钟左右，取出玻片用水冲洗，空气中自然干燥。

④ 阅片要求。在低倍镜下检查制片质量，制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分散、互不重叠、长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。用油镜进行细胞中期染色体分析。每只动物分析 100 个中期相细胞，每个剂量组不少于 1000 个中期相细胞。主要观察染色体数目改变和染色体结构变异两种情况。

1. 受试物应设 3 个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和（或）个别动物出现死亡的剂量，一般可取 1/2 LDso，低剂量组应不表现出毒性，分别取 1/4 LDso 和 1/8 LDso 作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出 LDso 时，高剂量组则以以下顺序：

① 10 g/kg；

② 人的可能摄入量的 100 倍；

③ 一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。

2. 医疗器械材料浸提液受试物样品可按以下的剂量浓度试验。采用 3 个剂量，分别为 100% 浓度（浸提液原液），50% 浓度和 25% 浓度。OECD 建议的浓度为 2~3.16 倍增长。

3. 另设溶剂对照组和阳性对照组，阳性对照物可用丝裂霉素 C（1.5~2.0 mg/kg）或环磷酰胺（40 mg/kg）腹腔或者静脉注射给予。