丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

骨髓微核试验

相关实验:遗传毒性试验

最新修订时间:

简介

20 世纪 70 年代初,Matter 和 Schmid 首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物,建立了微核测定法,凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物,都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核,但有核细胞的胞质少,微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。

原理

骨髓微核试验的基本原理是各种类型的骨髓细胞都可形成微核,但有核细胞的胞质少,微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段,此时红细胞的主核已经排出,因胞质内含有核糖体,吉姆萨(Giemsa)染色呈灰蓝色,成熟红细胞的核糖体已消失,被染成淡橘红色(图 10 - 5-2)。骨髓中嗜多染红细胞数量充足,微核容易辨认,而且微核自发率低,因此,骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。

材料与仪器

器材:

生物显微(需要放大倍数为 10 x 100 的目镜和物镜)、解剖剪、镊子、止血钳、1 ml 注射器、载玻片、盖玻片(24 mm x 50 mm)、塑料吸瓶、纱布、滤纸等。

试剂:

① 小牛血清

② 吉姆萨染液(称取吉姆萨染料 3.8 g,加入 375 ml 甲醇(分析纯)研磨,待完全溶解后,再加入 125 ml 甘油,置 37 ℃ 恒温箱保温 48 小时振摇数次,过滤,两周后用。吉姆萨应用液:取 1 份吉姆萨染液与 6 份磷酸盐缓冲液混合而成,临用时配制)

③ 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.8)(磷酸二氢钾(KH2PO4)4.50 g,磷酸氢二钠(Na2HPO2•12 H2O)11.81 g,加蒸馏水至 1000 ml)

④甲醇(分析纯)

步骤

骨髓微核试验的基本过程可分为如下几步:

(一)标本制备


A 采用两次给药法,两次给受试物或浸提液间隔 24 小时。经口材料进行灌胃操作。液体材料或浸提液经腹腔或静脉注射。

阴性对照组小鼠,注射等体积的浸提介质。

阳性对照组小鼠,注射环磷酰胺溶液,静脉注射 40 mg/kg,腹腔注射 60 mg/kg。

B 第一次注射后 24 小时,以相同剂量的浸提液、阴性和阳性对照液分别给每只小鼠再次注射。观察记录注射后小鼠的异常反应。

C 第二次给受试物后 6 小时,以颈椎脱臼法处死动物。立即取出股骨,去除软组织并剪去股骨两端部分组织,用带针头的注射器滴 5~6 滴小牛血清在载玻片上,然后剪碎股骨与血清混合均匀,用一张推片匀速推片制得涂片。每只动物至少做两张涂片,用记号笔在涂片的一端写明标本编号,标本编号应与动物编号一致。涂片自然干燥后放入甲醇中固定 5~10 分钟。当日固定后保存。将固定好的涂片放入吉姆萨应用液中染色 10~15 分钟,立即用水冲洗,晾干,写好标签后放入片盒中保存。镜检,每只动物计数 1000 个嗜多染红细胞数中含有微核的细胞数,各组动物的微核率结果以千分率表示。

(二)阅片


A 选择细胞完整、分散均匀,着色适当的区域,在油镜下观察。以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。本试验观察的指标为嗜多染红细胞的微核。用吉姆萨染色法,嗜多染红细胞呈灰蓝色,成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐,嗜色性与核质一致,呈紫红色或蓝紫色,直径通常为红细胞的 1/20~1/5。

B 数据处理一般采用 x2 检验、泊松分布、或双侧:检验等统计方法进行数据处理,并按动物性别分别统计。

试验时应注意防止小牛血清污染;股骨须擦拭干净,以免影响结果;涂片不要过厚或过薄;选择分布均匀、疏密适度、形态完整、染色好的区域镜检。由低倍镜到高倍镜,并按一定顺序镜检;注意微核与颗粒异物的区分,嗜多染红细胞与其他骨髓细胞不同阶段血细胞区分。

来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序