DNA的片段化

琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺(PAGE)电泳是分离、鉴定和纯化DNA的标准方法。琼脂糖凝胶的分辨率比聚丙烯酰胺电泳低，但分离范围广，可以分离200 bp一50 kb的DNA。细胞凋亡时染色体从核小体间断裂形成大小为180-200bp整数倍的片段，在琼脂糖凝胶中电泳后可呈现出规则间隔180-200bp的特征性“梯形带”。

1．试剂

(1)细胞裂解液：10 mmol／L Tris-HCL(pH 8，0)，150mmol／LNaCl，10mmol／LEDTA，0．4％SDS，蛋白酶K 100ug／m1。

(2)RNase(10 mg／m1)：RNase溶解于100 mmol／LTris-HCl(pH 7．5)及15 mmol／L NaCl中。煮沸15 min后缓慢冷却至室温，-20℃储存。

(3)TE缓冲液：Tris-HCllommol／I(pH8．0)，1 mmol／LEDTA(pH8．0)。

(4)其他试剂：醋酸钠(pH 5．2，3mol／L)、饱和酚、异戊醇、氯仿、无水乙醇等。

2．实验步骤

(1)细胞收集：常规离心收集1-5X106 细胞，注意因凋亡而悬浮的细胞和贴壁的细胞要同时收集。弃上清液，PBS洗1次。加入0．5m1细胞裂解液，在50℃中放置3-5h，以裂解细胞。

(2)在细胞裂解液中加入等体积饱和苯酚抽提，6 000r／min离心5rain吸取上清液，再依次用等体积酚：氯仿(1：1)，氯仿：异戊醇(24：1)抽提，6 000r／min离心5min吸取上清液。

(3)加入2．5倍体积预冷的无水乙醇，1／10体积醋酸钠(3 mol／L，pH＝5．2)，一20℃15min，12 000r／min离心30min。

(4)弃上清液，70％乙醇洗1次。沉淀晾干后溶于100／ul TE缓冲液。

(5)加5／ul RNase，37~C水浴30mid。取20ul DNA混合缓冲液后上样，1％琼脂糖凝胶电泳(50V，1．5～2h)，UV下观察。

细胞凋亡时核酸内切酶激活而切割DNA使之单链断裂。原位末端标记(in situ end labeling，ISEL)是将掺入到凋亡细胞中的外源性核苷酸，在酶如末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase，TDT)、DNA聚合酶I或Klenow大片段等的催化下，与凋亡细胞单股或双股DNA断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。比较常用的有两种方法：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUT Pnick end labeling，TUNEL)和DNA聚合酶I或Klenow大片段介导的原位缺口平移(in situ nic translation，INST)。根据标记在dUTP上的标记物和显示系统的不同，可以做组织学染色在普通光镜下计数或用流式细胞仪(以荧光素标记dUTP)分析。ISEL本身并不能区别凋亡和坏死，必须结合其他标准，如凋亡小体形成、周围或局部无炎症反应。