干货| CUT and Tag 技术全方位解答

CUT&Tag 适用于哺乳动物细胞的蛋白-DNA 互作研究，酵母、植物等细胞需要经过(破除细胞壁或者提取细胞核)来进行实验。CUT&Tag 在哺乳动物细胞系上的应用比较成熟，动物组织经过处理得到悬浮单个细胞同样可以进行实验。植物进行 CUT&Tag 操作可以参照 Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN (PMID:30719569) 的前端处理。

2. CUT&Tag 技术公布的 Protocol 适用于活细胞，对细胞状态有要求吗？那么经过 PFA 交联过的细胞可以使用吗？

CUT&Tag 在活细胞上确实成功率比较高，在准备细胞时需要保证细胞处于高细胞活性状态，若细胞活性不佳，胞内蛋白质与核酸相互作用的状态会发生改变，对于死亡的细胞，目的蛋白有可能从染色质上脱落，进而影响实验数据。在准备细胞样本时使用台盼蓝进行细胞活性的检测，建议细胞活力大于 90% 以上。经过 PFA 交联过的细胞同样也适用于 CUT&Tag ，但我们不建议使用 PFA 交联的细胞进行实验，因为经过交联的细胞有可能会引起表位覆盖，从而降低数据质量。

3.针对于 Tn5 切割开放染色质区域的特性，CUT&Tag 是否更加适合于开放染色质区域的研究，异染色质上的位点是否适用？

CUT&Tag 是 ChIP-seq 的替代技术，主要用于分析全基因组范围内的 DNA-蛋白质相互作用。容易将 ATAC-seq 技术与CUT&Tag 技术混淆，CUT&Tag 技术在异染色质位点上有很好的结果，Henikoff 推荐的阳性对照就是存在于异染色质区域的 H3K27me3，且我们的客户在 H3K27me3 以及 H3K27AC 上都有很好的结果。

ConA beads 是经过 Concanavalin A（刀豆蛋白A，ConA）包被的磁珠。ConA 是一种从刀豆和豌豆等籽粒中提取出来的植物凝集素，四聚体球蛋白，含有糖基结合位点，因此 ConA 是一种糖类结合蛋白。ConA 磁珠能与细胞膜上的糖蛋白结合，从而吸附细胞，使对细胞的实验操作可视化，减少在后续实验过程中的细胞的损失。

不建议使用离心法代替 ConA beads，因为离心法不适合于低细胞数，在洗涤的过程中，损失很大，而且大肠杆菌残留的 DNA 无法进行可靠的校准。

ChIP-seq 和 CUT&Tag 都可以研究基因组范围内的 DNA-蛋白质互相作用，但是这个是两个完全不同的技术。ChIP-seq 需要一抗与 pA/pG 磁珠进行结合，钓取目的区域。CUT&Tag 实验中的二抗作用是放大信号，在丰度很高的靶蛋白不使用二抗也可以构建出 CUT&Tag 文库，建议使用二抗。不建议使用带修饰的二抗进行实验，防止因为表位的覆盖影响二抗与 pA/pG-Tn5 结合的效率。

针对抗体的阳性对照可以采用 RNA Pol II/ 组蛋白，证明系统没有问题。阴性对照使用与一抗相同种属的 IgG ，阳性对照，阴性对照证明抗体特异，实验结果可信。

被提取的 DNA 片段，只有加上了接头的 DNA 片段才能在后续的 PCR 扩增中富集，通过 PCR 扩增可以特异性的富集目的片段。

可以用 Qubit 进行浓度检测，Agilent2100 等可以检测片段分布的仪器进行文库峰型检测（如果研究组蛋白修饰，可以得到梯状条带分布）。如果没有检测片段分布的仪器，可以考虑使用 2% 的琼脂糖凝胶电泳代替，但是灵敏度会低，组蛋白修饰实验也有可能看不到典型的梯状条带。如果做转录因子，上机之前可以根据 ChP-seq 数据库里面的 peak 设计引物检测与 GAPDH 等内参位点对照，通过 qPCR 来确定目的靶点的富集程度。