干货 | CUT and Tag 让 ChIP-Seq更简单高效！
诺唯赞
CUT&Tag 技术原理及应用
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是替换传统的 ChIP-Seq 用以研究蛋白质-基因组互作的新技术，与后者相比，它具有信噪比高、可重复性好、实验周期短（1 天实现从细胞到文库构建）、细胞投入量低等显著优势，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。
图 1. CUT&Tag 实验原理
CUT&Tag 技术的实验流程简单，可一步实现 DNA 的片段化和接头连接，仅需 9h 即可实现从细胞到二代测序文库的转化。
①收集细胞；
②分别孵育一抗和二抗；
③孵育 pA/pG-Tn5 转座子（Hyperactive pA/pG-Tn5 Transposon）；
④激活转座子，进行 DNA 片段化；
⑤DNA 提取；
⑥文库扩增与纯化。
1. 细胞起始量低
投入不同起始量的 HEK293 细胞（ 100 或 10,000 个细胞），按照 Vazyme #TD901 说明书推荐的反应体系进行 CUT&Tag 实验；其中，pG-Tn5 转座子使用的终浓度为 0.04μM ，一抗为 H3K27me3（CST，#9733），二抗为 Goat anti Rabbit（Bioworld，#BS13271）。
A、文库峰型检测
使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 进行文库分布检测。
图 2. 使用 TD901 构建 100 cells CUT&Tag 文库峰型图
图 3. 使用 TD901 构建 10,000 cells CUT&Tag 文库峰型图
结果显示：对于不同细胞投入量（ 100 个或 10,000 个细胞），均可构建出与文献中类似的呈现 Ladder 状的文库，说明该体系能够兼容低细胞起始量的实验。
B、Peak 富集
将构建好的文库使用 Hiseq X10 PE150 进行文库测序，将下机数据过滤后进行 peak calling。
图 4. 使用 TD901 构建不同细胞投入量 Peak 富集情况
（第一列为 ChIP-Seq 数据，第二列为 100 cells 数据，第三列为 10,000 cells 数据）
结果显示：100 个细胞可以达到与 10,000 细胞类似的 Peak 富集，且信噪比显著高于 ChIP-Seq。
2. 转座子切割活性高
pG/pA-Tn5 是 CUT&Tag 技术中的关键核心酶，需要具有高活性，才能保证对微量 DNA 的高灵敏度和高亲和力，有效抓取数十个细胞中的有限结合位点。
A、基因组 DNA 打断效果
对 Vazyme # TD902 中提供的 pA-Tn5 转座子以及 undefined 公司的 pA-Tn5 转座子进行活性检测，投入 50ng 人基因组 DNA ，各取 1μl 转座子进行 DNA 片段化（10 min），扩增后使用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测产量以及分布情况。
图 5.转座子活性检测结果图
结果显示：Vazyme pA-Tn5 融合酶切割 DNA 活性很高，文库产量显著高于 undefined 公司同类产品。
B、活细胞 CUT&Tag 实验
投入 10,000 个 HEK293 细胞，分别使用 Vazyme #TD902 与 undefined 公司同类产品，按照各自说明书推荐的反应体系进行 CUT&Tag 实验；其中，pA-Tn5 转座子使用的终浓度为 0.04μM ，undefined 公司转座子按照 1:100 进行稀释，一抗 H3K27me3（CST，#9733），二抗为 Goat anti Rabbit（Bioworld，#BS13271）。使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 比较 CUT&Tag 文库分布。
图 6. TD902 CUT&Tag 文库峰型图
图 7. undefined 公司同类产品 CUT&Tag 文库峰型图
结果显示，Vazyme的pA-Tn5转座子切割活性明显高于undefined公司同类产品，可构建出与文献报道类似Ladder状CUT&Tag文库。
3. 信噪比高
将活细胞 CUT&Tag 实验中构建的文库使用 Hiseq X10 PE150 进行文库测序，将下机数据过滤后进行 peak calling 。
图 8. CUT&Tag Peak 富集情况比较
（第一行为 ChIP-seq 数据，第二行为 TD902 数据，第三行为 undefined 公司同类产品数据）
结果显示：在细胞投入量 10,000 的情况下，使用 Vazyme #TD902 获得的文库信噪比显著优于 undefined 公司同类产品。
4. 实验重复性好
投入不同起始量（1,000、10,000 或 100,000）的 HEK293 细胞，每种起始量做 2 个重复，按照 Vazyme #TD901 说明书推荐的反应体系进行 CUT&Tag 实验；其中，pG-Tn5 转座子使用的终浓度为 0.04 μM ，一抗为 H3K27me3（CST，#9733），二抗为 Goat anti Rabbit（Bioworld，#BS13271），阴性对照为与一抗同源的 IgG（CST，#2729）。将构建好的文库使用 Hiseq X10 PE150 进行文库测序，针对富集的 reads 进行 pearson 相关性分析。
图 9. TD901 CUT&Tag 文库重复相关性展示
结果显示：使用TD901构建的不同细胞投入量的CUT&Tag文库，平行样本之间重复性好。
文章图文来源：诺唯赞生物
