干货 | CUT and Tag 核心酶 Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase 大解密
诺唯赞
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是蛋白-DNA 互作的一大革新技术，它不需要使用甲醛交联以及免疫共沉淀，而是通过针对靶蛋白（如转录因子、染色质重塑蛋白）的抗体和 Protein A/G 的介导，使得与 Protein A/G 融合的 Tn5 酶(Tagmentase)在切割 DNA 片段的同时在序列两端加上测序接头，经 PCR 扩增后即可形成用于高通量测序的文库（见图 1 ）。CUT &Tag 技术具有细胞投入量低、信噪比高、实验周期短（ 1 天实现从细胞到文库构建）、可重复性好等显著优势，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。
图 1. CUT&Tag 原理图
由于 CUT&Tag 主要是针对极低细胞起始量进行实验，因此对核心酶原料有着极高的要求。CUT&Tag 技术的核心原料酶是 Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase ，它具有高活性，对微量 DNA 有高灵敏度和高亲和力，能有效抓取数十个细胞中的有限结合位点等特点。
Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase结构
Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase 的 N 端结构域为金黄色葡萄球菌 A 蛋白(Protein A) 的一部分或链球菌 G 蛋白(Protein G)一部分，C 端结构域为 Tn5 。两个结构域通过短的刚性连接肽（Linker Peptide）连接，使得融合蛋白酶兼具 PA/PG &Tn5 活性。通过针对靶蛋白（如转录因子、染色质重塑蛋白）的抗体和 Protein A/G 的介导，Tn5 Transposase 可以实现切割靶区域的目的。
图 2.Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase 示意图
Protein A/G
Protein A 来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有 5 个可以和抗体 IgG 分析的 Fc 段特异结合的结构域。Protein G 是一种源自链球菌 G 蛋白的细胞表面蛋白，为三型 Fc 受体。与 Protein A 类似，Protein G 也可以与 IgG 的 Fc 段特异性结合，不同的是，Protein G 还可以和某些抗体的 Fab 和 F（ab’）2 段结合。
Tn5转座酶
转座酶是一大类细菌来源的蛋白，通过结合转座子序列末端并催化其转移到基因组上随机位置，实现“剪切-粘贴”或“复制-粘贴”型的 DNA 插入的作用。其中 Tn5 转座子因其转座的随机性好、稳定性高、插入位点容易测序等特点，已经成为分子遗传学及基因诊断学研究的热门工具。
Tn5 转座子是一种细菌转座子，全长约 5.8 kbp ，由编码三个抗生素（新霉素、博莱霉素、链霉素）的核心序列和两条倒置的 IS50 序列组成。其中 IS50R 和 IS50L 的序列高度同源，只是 IS50L 的一个碱基存在突变。IS50 具有 19bp 的倒置末端（ES），外末端 outside end（OE）和内末端 inside end（IE），两末端倒置有 7 个碱基不同。此倒置末端是转座酶（Tnp）的作用位点，在转座过程中，将转座子从供体 DNA 中完全切除，并插入到目标 DNA 中。IS50L 和 IS50R 均含有编码转座酶（TnP）以及转座阻遏蛋白（lnh）的基因，但由于 IS50L 中的碱基突变，造成翻译提前终止，所以仅有 IS50R 可以产生正常的有活性的 TnP 和 lnh。
图 3. Tn5 转座子结构[1]
60 bp 的转座子底物由 20 bp 的 dbb（ ES-donor backbone，ES 供体主链），19 bp 的 ES 和 21 bp 的转座子组成。
图 4. 60 bp 的转座子底物结构[1]
Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase 作用机制
Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase 利用 PA/PG 寻找不同来源的抗体，结合在靶蛋白的附近后再进行切割。它的切割作用由 Tn5 转座酶实现，Tn5 转座酶作用机制主要分为三步：
转座酶（Tnp）分子（红色）与转座元件末端与特定的 19 bp ES 识别序列（白条）结合，形成两个 TnP-ES 复合体。随后两个 TnP-ES 复合体通过 TnP 的 C 末相互作用进行联会，形成 Tn5 转座酶复合体。
在 Mg2+ 存在下，Tnp 活化水分子，活化的水分子进行亲核攻击，水解 DNA 的一条链，从而在转座子末端暴露出一个 OH 基团。然后激活此 OH ，以对 DNA 的互补链进行亲核攻击，形成发夹结构并切割 DBB ，并产生 DEB 复合物（具有两个切割末端的联会复合物）。每种单体都与它自己的 ES（顺式接触）和与其他单体结合的转座子 ES 都进行接触（反式接触）。每个 Tnp 的催化结构域以这样的方式定位：切割另一个单体的转座子末端（反式切割）。
在 DEB 复合物与非特异性靶 DNA 结合后，转座子末端的活化的 3′-OH 基团对靶 DNA 进行亲核攻击，以 9 bp 的间隔完成链转移。Tnps 离开目标 DNA ，缺口被修复，产生 9 bp 的重复。
图 5. Tn5 转座酶作用机制[1]
研究人员发现，整个转座子序列并不是转座必须的，只需转座子的 19 bp 末端核心序列，转座酶便能将该部分序列插入并连接至基因组内。利用这个原理，将测序接头序列加入到末端核心序列中，在转座酶进行片段化的同时，加上了测序序列，省去了接头连接的过程，只需在片段化后进行 PCR 扩增便可得到完整的用于测序的文库。但是这一步之后，接头与插入片段之间有 9 bp 的 gap 需要补平（如图 6 ），这就是为什么 Tn5 建库在 PCR 之前必须进行 72℃ 反应 3min ，而且所用的 PCR 酶需是具有链置换功能的非热启动酶。
图 6. Tn5 文库缺口补平
传统建库方式需要经过 DNA 片段化、末端修复、接头连接、文库扩增等步骤，耗时较长，而使用 Tn5 转座酶进行文库构建，可将 DNA 片段化、末端修复、接头连接等多步反应转变为一步简单的酶促反应，极大缩短建库时间，提高工作效率。
图 7. 转座酶文库结构
Vazyme Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase优势
切割活性高
野生型 Tn5 转座酶的活性很低，以减少对宿主产生致命突变的风险。Tn5 转座酶活性很低的部分原因在于其蛋白的 N 端和 C 端在三维空间构象上相互接近，并发挥相互抑制的作用。诺唯赞专注于酶改造，使用基因工程手段对于 N 端或 C 端的突变，可以得到高活性形式的突变形转座酶。使用 Vazyme pA-Tn5 与市面上 A 公司同类产品使用 50 ng gDNA 在 55℃ 条件下打断 10 min 后，扩增 9 个循环，利用 Qubit 检测浓度比较转座酶活性，发现 Vazyme PA-Tn5 切割活性远远高于 A 公司同类产品。
图 8. Vazyme pA-Tn5 与 A 公司同类产品产量比较图
核酸残留低
由于 Tn5 转座酶对 DNA 有极高的亲和力，导致了纯化过程中易产生非特异核酸残留。Henikoff 实验室设计不同投入量细胞进行 CUT&Tag 实验，并分析不同投入量下 E.coli 残留情况。发现随着细胞投入量下降，E.coli reads 越多。
图 9. 不同细胞投入进行 CUT&Tag 实验得到的目的 reads 与 E.coli 残留结果展示[2]
诺唯赞生物针对 Tn5 酶非特异性核酸残留问题进行攻克（见图 11），优化酶生产工艺，大大降低了低起始量细胞建库中非特异核酸占比。
图 11. pA-Tn5 核酸残留与公司核酸残留比较
核酸残留检测方案：实验人员使用 PA-Tn5 裸酶进行 PK 消化，富集并回收核酸。设计针对细菌 23S 通用 qPCR 引物，对回收的核酸进行 qPCR 检测，计算 E.coli 核酸残留。
过去三年间，北大清华等多所高校院所使用诺唯赞 Tn5 转座酶发表的高影响因子文章 14 篇，其中 CNS 有 7 篇。其中 2020 年 1 月 13 日，北京大学系统生物医学研究所尹玉新课题组在国际免疫学领域顶级期刊 Nature immunology 在线发表了题为 The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity 的研究论文，揭示了磷酸酶 PAC1 作为 T 淋巴细胞功能抑制因子，可以减弱宿主细胞免疫监视功能，促进肿瘤免疫逃逸的作用机制。该文章使用了 Vazyme Tn5 转座酶（TD501）进行 ATAC-seq 实验以及 PA-Tn5（S603）进行 CUT&Tag 实验。
参考文献：
[1] Vaezeslami S , Sterling R , Reznikoff W S . Site-Directed Mutagenesis Studies of Tn5 Transposase Residues Involved in Synaptic Complex Formation[J]. Journal of Bacteriology, 2007, 189(20):7436-7441.
[2] Hatice S, Kaya-Okur, Steven J,等. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.[J]. Nature communications, 2019.
[3] Lu D , Liu L , Sun Y , et al. The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity[J]. Nature Immunology, 2020, 21(3):1-11.
文章图文来源：诺唯赞生物
