简单序列重复标记

分子标记（molecular marker）是遗传标记（genetic marker）的一种，是在基因水平上的标记，直接在 DNA 分子上检测遗传变异，用作指示基因组范围变化的多态性标记。分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制，正是因为这些优点，分子标记的应用越来越广泛。它包括 RFLP、RAPD、AFLP、SSR 等。

长期以来，植物学研究中选择都是基于表型性状、形态学、结构等方面进行的，当性状的遗传基础较为简单或即使较为复杂但表现加性基因遗传效应时，表型选择是有效的。但物种的许多重要表型性状为数量性状，如产量等；或多基因控制的质量性状，如抗性等；或表型难以准确鉴定的性状，如根系活力等。此时根据表型提供的对性状遗传潜力的度量是不确切的，因而选择是低效的。分子生物学技术的发展为植物科学研究提供了一种基于 DNA 变异的新型遗传标记——DNA 分子标记，或简称分子标记。与传统应用的常规遗传标记相比，分子标记具有许多明显的优点，因而已被广泛应用于现代植物研究的各个方面，大量以前无法进行的研究目前利用分子标记手段正蓬勃开展，并取得了丰硕的成果。尤其是当分子标记技术与传统形态结构紧密结合后，正在为植物科学技术带来一场新的变革。

分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为 3 大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）标记、DNA 指纹（DNA fingerprinting）技术、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性 DNA（random amplification polymorphism DNA，RAPD）标记、简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）标记或简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism，SSLP）标记、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记、序标位（sequence tagged sites，STS）标记、序列特征化扩增区域（sequence charactered amplified region，SCAR）标记等；第三类是一些新型的分子标记，如单核昔酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记、表达序列标签（expressed sequences tags，EST）标记等。以下将介绍其中最常用的一些标记技术。

简单序列重复标记也称微卫星（microsatellite）分子遗传标记，指存在一真核生物基因组中由短的重复单元（一般为 1~6 个碱基）组成的 DNA 串联重复序列，是具有高度多态性、共显性和重复性的遗传标记。例如，微卫星（GA）_n 或（TC）_n 重复，不同等位基因的 n 值不同（图 42-7）。SSR 标记往往代表了种内、种间高层次的多态性，尤其是当重复次数达到 10 或更高的时候。SSR 标记操作简单，仅需微量组织即可进行遗传相关性的分析鉴定，SSR 标记技术已经成为植物群体遗传学研究中的一种被广泛应用的工具。同时，SSR 标记也被广泛应用于群体遗传结构研究、遗传多样性研究、基因组图谱研究、指纹谱图和亲子鉴定分析、基因流研究。

SSR 分子标记原理：根据两端序列的保守性，设计引物；进行 PCR，电泳分离，染色显带以检测、分析微卫星序列多态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成功鉴定的目的。简而言之，就是通过对样本 DNA 多态性的分析，从而来得到样本 DNA 序列，以及在遗传性状上的调控和差异（图 42-8）。

器材：

各种植物叶片材料、黄豆和蚕豆。

器具：

PCR 仪、移液枪、1.5 mL 离心管、PCR 扩增管、电泳仪、梳子、硝酸纤维素膜、尼龙膜、Bio-Rad 凝胶成像仪、垂直电泳槽、微量加样器、Tip 头、研钵、移液管、离心机。

试剂：

1 mol/L 盐酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铉、蔗糖、漠化乙锭、漠酚蓝、乙酸联苯胺溶液、过氧化氢、琼脂糖、引物、MgCl₂、dNTP、Taq DNA 聚合酶、PCR Buffer 溶液、硅胶、甲酰胺、SB 缓冲液 100 bp DNA ladder、冰醋酸、AgNO₃ 甲醛、Na₂S₂O₃、ddH₂O。

简单序列重复标记的基本过程可分为如下几步：

1）准备植物材料

实验中用的叶片材料为秦岭山脉中收获自 50 棵健康植物野核桃（Juglans cathayensis^釆集当年生鲜嫩叶片 2 或 3 片，硅胶干燥后运回实验室备用。

2）DNA 的提取与分离

DNA 的提取与分离是在 Doyle 和 Poyle 等提出的 CTAB 法（Doyle and Poyle，1987）的基础上进行了改良。详细的核桃基因组 DNA 提取方法描述见实验三十九。

3）SSR 引物对筛选

实验采用的引物来自于黑核桃（J.nigra）微卫星基因文库，详细描述见儿篇已经发表的关于核桃微卫星实验的文献（WoesteetaL，2002；Dangel et al.，2005；Victory et al.，2006）（表 42-2）。共收集了 12 个 SSR 引物（AAG001、WGA06、WGA24、WGA27、WGA32、WGA69、WGA72、WGA76、WGA82、WGA89、WGA90 和 WGA97），正向引物（5'—3' 分别用 NED、HEX 或 6-FAM 荧光标记末端，根据 3 种荧光标记的颜色分成 4 组，以便进行多重 PCR 反应（表 42-2）。SSR 分子标记的重复和再生性在前面的基因型测定实验中已经证实了。SSR-PCR 扩增和 12 对引物由 Integrated DNA Technologies（IDT）公司合成（San Diego，California，USA）。共 12 对微卫星引物应用于本实验，并且用荧光标记于一端引物序列（表 42-2）。Taq DNA 聚合酶反应缓冲液［100 mmol/L Tris-HCl，pH8.8，15 mmol/L MgCl₂，500 mmol/L KCI 和 0.01%（W/V）gelatin］ 购于 Stratagene 公司（La Jolla，California，USA），Taq DNA 聚合酶、dNTP 和牛血清蛋白（BSA）购于 Promega 公司（Madison，Wisconsin，USA）。PCR 反应体系 lOgL，其中 dNTP 0.2 mmol/L，BSA 0.5 mg/mL，Taq DNA 聚合酶 0.3 U，引物浓度为 0.8 μmol/L，Mg²⁺ 浓度为 1.5 mmol/L，DNA 模板质量浓度为 5 μg/L。当一种反应成分进行浓度（用量）梯度变化实验时，其他反应成分浓度不变，分析比较不同处理对 SSR-PCR 扩增结果的影响。PCR 反应成分的处理因素和水平设计见表 41-1。PCR 扩增程序为：94 ℃ 变性 5 min；93 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，35 个循环；72 ℃ 后延伸 10 min，置 4 ℃ 保存。3 对引物同时应用于一个 SSR-PCR 的反应体系实验是在单对引物 SSR-PCR 优化好的基础上进行的。

4）PCR 产物的检测

取 4 μL PCR 产物，与 0.5 μL 染液 ［40%（W/V）蔗糖，15% ddH₂O 和 30% 甘油］ 混合点样，电泳釆用 1× SB 缓冲液制成的 2.5% 琼脂糖凝胶，凝胶中加入荧光嵌入染料漠化乙锭（ethidium bromide，EB），在 90 W 恒功率电泳约 1.5 h，待溟酚蓝指示剂跑至接近凝胶底部时，终止电泳（图 42-9）。用凝胶成像仪（75312 Bad Wildbad，Germany）检测 PCR 产物，DNA 片段大小标准用 100 bp ladder（购于 Promega 公司，Madison，Wisconsin，USA）。

5）PCR 产物的测定

PCR 扩增后，样品以 1：10 的比例在水中稀释，1μL 吐稀释后的 PCR 产物加入 13.4 μL 甲酰胺（Invirogen，Carlbad，CA）和 0.6 μL Rox 荧光标记分子量内标的试剂。将这 15 μL 混合的产物和试剂放入 PCR 仪器里，在 95 ℃ 下加热 5 min 后，立即放到冰上冷却 3 min，送至专业实验室进行测序分析（如果不进行这一步实验，也可以直接到下一步）。

6）扩増产物电泳分离

一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳或者特殊的琼脂糖凝胶检测扩增产物。

7）染色

（1）银染。① 银染液的配制：固定液，100 mL 冰醋酸加水稀释至 1000 mL；染色液，2 g AgNO₃、1.5 mL 37% 甲醛，加水稀释至 1000 mL；显色液，30 g Na₂CO₃、1.5 mL 37% 甲醛、0.2 mL Na₂S₂O₃，加水稀释至 1000 mL；终止液，10% 冰醋酸。② 银染法操作：固定 30 min→去离子水洗涤 5~10 min→染色 30 min→去离子水洗涤 2 次（每次不超过 30 s）→显色至所要程度→终止显影→照相（图 42-10）。

（2）溴化乙锭染色。将 EB 贮液（10 mg/mL）用双蒸水稀释至 0.5 μg/mL，EB 染色操作：将电泳后的凝胶放入染色液中 30 min，染色后的凝胶放入蒸馏水中清洗 5 min，再将凝胶放入紫外凝胶成像仪观测结果。

8）数据分析

对 SSR 标记分析得出的数据结果进行整理、统计。对于基因型数据分析，SSR-PCR 产物用 ABI 373 遗传测序分析仪进行分析。在每 96 个 PCR 反应的平板上设置了两个正面的和一个负面的对照，以确保 PCR 产物测序后用软件分析等位基因大小值得评测。根据四色荧光技术原理得到测序（等位基因）数据（图 42-11），然后，用生物软件 Genemapper 3.7（Applied Biosystem，Foster City，CA）对群体每个样品的 SSR 基因位点进行分析得出等位基因的大小值。平均值用 Excel（Microsoft Office，2007）和统计软件 SAS 9.1（SAS Institute，Cary，NC）进行统计分析。生物软件 CERVUS（Kalinowski et al.，2006）和软件 Kingroup（Konovalov et al.，2004）用于估算和分析群体遗传参数标准和鉴定分析亲缘关系。3 种方法用来进行家系分析和家谱鉴定，具体描述见 Mifio 等 2009 年发表的相关文章（MihoetaL，2009）。父系分析的排斥原则为候选父本或者可疑的父本在所有基因位点上有 3 个等位基因确定与子代植株不匹配的现象。同时在所测定的 12 个微卫星基因位点中至少 3 个等位基因大小不同，以此来避免错误的排除或者无效等位基因（millalleles）的存在。