通过 RFLP 技术进行 VNTR 分析

待测个体的DNA 一般从全血分离
限制性内切核酸酶及合适的缓冲液 微型琼脂糖凝胶 DNA 分子质量大小标记 分析琼脂糖凝胶 1 X TBE 缓冲液 溴化乙锭 NaOH 2 X SSC
放射性或非同位素标记的 DNA 探针 尼龙膜 Whatman 3MM 滤纸 X 线胶片 孵育器

1.选择合适的限制性内切核酸酶完全消化 DNA 样品。严格按照生产商要求设定酶切条件（注意星活性）。

2.将每个酶切的 DNA 样品及酶切和未酶切的对照 1 ul 载样至 0.6% (m/V) 微型琼脂糖凝胶，按照附加方案 1 第 9~10 步进行电泳并照相。如果酶切不完全，增加酶量并延长酶切时间。

3.将 DNA 分子质量标记物、母亲样品、小孩样品、声称的父亲样品和家系外个体对照样品载样至 IXTBE 缓冲液浸泡的 20 cm，0.7%~1.0% 分析琼脂糖凝胶。将 DNA 分子质量标记物载样至第一个和最后一个点样孔（或紧靠第一个和最后一个样品）。

4.以 40V 电泳过夜或直至溴酚蓝染料迁移至凝胶的边缘，电泳缓冲液可回收使用。

5.以溴化乙锭染胶并照相（尽量减少 UV 暴露）以记录 DNA 消化、迁移距离及 DNA 浓度对比情况（支持方案 1，第 9~10 步）。

6.通过毛细转移将 DNA 从凝胶转移至尼龙膜，使用标准 Southern 印迹技术进行电印迹或真空印迹（附录 3G)。

7.按照标准方案进行探针与膜的杂交。每毫升杂交溶液使用 2 X 105 cpm 探针。

8.根据探针，以严格条件洗脱印迹（附录 3G)。

9.倒掉最终洗脱液，用 Whatman3 MM 滤纸吸去膜上多余的液体。用塑料薄膜包裹膜，与 X 线胶片曝光（如采取夹心三明治的方式），放射性探针曝光 12~48 h，非放射性的时间稍短。

10.一旦自显影形成，在 350 ml 50°C 的 0.2 mol/L NaOH 溶液中，持续轻柔振荡，洗涤杂交膜 30 min 以使探针条带显现。倒除 NaOH 重复洗涤一次。室温下，用 350 ml 0.2 mol/L Tris·Cl，PH7.5/2 X SSC 溶液，持续轻柔振荡清洗印迹约 30 min。再以约 300 ml 2 X SSC 溶液简单清洗。重复进行另外一个位点探针的杂交或干燥膜，以塑料薄膜包裹，室温保存至多 5 年。

11.在给胶片标记上样品名称前，仔细检查自显影像的质量及合适条带的强度。

12.确定条带的分子质量大小（如采用 DNAVIEW 时会自动调用 Numonicsdigitizer)。

如果使用了两种不同的方法确认条带分子质量大小，比较不同的读值以确定其准确性，取平均值。每次均须确认家系外个体对照的条带大小。