回收.连接.转化.克隆.测序

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DNA连接与转化 大肠杆菌的基因工程

连接:

目标片断回收后立即与pGEM-T载体 做连接反应。反应体系：2X连接buffer 5μl，回收产物 3μl，T载体 1μl，T4连接酶 1μl，共10μl;混匀，4℃放置16小时以上

转化:

1、从-70℃冰箱中取40μl感受态细胞悬液,冰上解冻。

2、 加入连接产物1-2μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻弹匀,冰上放置25分钟后。(38μl ddH2O+20μl KCM+50μl感受态)。

3、42℃水浴中热击45秒,热击后迅速置于冰上冷却2分钟。

4、向管中加入0.6ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌 恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。

5、在加有氨苄的琼脂 糖平板上预加40μl的X-gal和4μl的IPTG，推棒涂匀，放置10min让其充分吸收

6、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

7. 培养12小时后，挑选圆润的菌落转入另一个预加有40μl X-gal和4μl IPTG并划分不同区域的平板上，37℃培养8小时。

阳性克隆 的鉴定:

做菌落PCR挑选阳性克隆:在反应管中加入8μl无菌水，挑选单个菌落入管中，加10μl矿物油封住液面，95℃反应5min。结束后在每管中加入除模板外的其他反应体系，用量与反应条件与扩增相同。挑选电泳结果好的测序 。

注意事项

同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

1.将感受态细胞加入要转化的东东(一般原则是转化物体积不超过感受态细胞体积的十分之一)。冰上置半小时。

2.热休克：42度，时间30秒至120秒都可以。一般书上都是90秒。

3.复苏：热休克后加入4倍体积的无抗生素培养基SOC(如果嫌麻烦，LB也可)，37度摇一小时。转速最好低于220转/分钟。

4.涂板：4000转离心2-3分钟，多余上清不要，留约200UL将菌液混匀，推平板，直到菌液基本涂干。37度孵箱放12-16小时。