PCR产物的TA克隆 (DNA的胶回收和连接)

1.掌握DNA回收和连接的基本原理。
2.学习和掌握PCR产物的T-vector克隆。

1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

商品化的T载体有很多。本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。

（一） 试剂
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液
3.琼脂糖（Agarose）
4.6×电泳加样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。
5.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
6.70%乙醇
7.胶回收试剂盒（Omega公司）

（二）器材
水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。

（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司 Gel Extraction Kit为例）

1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。
2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积（假设其密度为1g/ml）。加入等体积的Binding Buffer（XP2），于55-65℃水浴中温浴7min或至凝胶完全融化，每2-3 min振荡混合物。（在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的话，DNA的产量将大大减少。如果是橙色或红色，则要加入5μl 浓度为5 M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。）
3.取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干凈的2ml收集管内（已备好）。
4.将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟。弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。
5.如果DNA/凝胶熔液的体积超过700ul，一次只能转移700ul至柱子中，余下的可继续重复第5步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibind DNA回收纯化柱都有一个极限为25μg DNA的吸附能力。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱子中。
6.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移300μl Binding Buffer（XP2）至柱子中，室温下， 10,000 x g下离心1min。
7.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移700μl SPW Wash buffer（已用无水乙醇稀释的）至柱子中。室温下10,000xg离心1min。（浓缩的SPW Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下）。
8.重复用700μl SPW Wash buffer洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。
9.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。
10.把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入15~30μl（具体取决于预期的终产物浓度）的Elution Buffer(或TE缓冲液)到柱基质上，室温放置1min, 13,000xg离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出70-80%的结合DNA。 如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。

（二）连接反应（以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit为例）

1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。
pMDTM18-T Simple Vector 1 μl
Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol
dH2Oup to 5 μl
2）加入5 μl（等量）的 Solution I。
3）16℃反应30分钟。（2 kbp以上长片段PCR产物进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时）。
4）全量（10 μl）加入至100 μl 感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
6）加入890 μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。
7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。
8）挑选白色菌落，鉴定载体中插入片段的长度大小。

1.使用新鲜的电泳缓冲液TAE Buffer。不要重复使用，其PH的升高会减少产量。
2.不论采取何种方法回收DNA，在回收过程中，要尽量减少洗脱体积，以便提高收得率和浓度，以方便后续操作。
3.从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm)，以减少紫外光对DNA的切割。DNA曝露在紫外灯下不能超过30秒。
4.连接反应时间是与温度密切相关，因为反应速度随温度的提高而加快。通常可采用16℃连接4小时为宜，如是平端连接需要适当延长反应时间以提高连接效率；在选择反应的温度与时间关系时，也要考虑在反应系统中其他因素的影响。
5.连接反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防止酶活性降低，取酶时应在冰上操作且动作迅速。7.
6.连接反应应在25℃以下进行，温度升高较难形成环状DNA，影响连接效率。长片段PCR产物（2kb以上）进行连接时，连接反应时间应延长至数小时。
7.进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1:2~10。根据实验情况选择合适的摩尔数比。
8.用高效的感受态细胞（转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。

9. 试剂 盒配有Control DNA。通过对照实验判断 试剂 盒的保存效果。

第一天下午：配制6×电泳加样缓冲液、TAE等缓冲液，将各种耗材灭菌。
第二天上午：制备琼脂糖凝（1%），电泳检测，切胶回收DNA片段
第二天下午：大肠杆菌制备感受态细胞；DNA与T载体连接转化大肠杆菌。
第三天上午：观察转化结果（蓝白斑情况），计算重组率。

1．PCR产物的T-vector克隆方法，应注意哪些操作环节？
2．和其他组结果比较，对本组实验结果进行分析。
3．对于用高保真Taq DNA 聚合酶 扩增的PCR产物，如何进行克隆？