请问 5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit 产品中的Blunt载体连接3Kb的片段，为什么连接不上?
常巧风
各位大神好！请问 5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit 产品中的Blunt载体连接3Kb的片段，为什么连接不上？按照最佳配比连接的。连接之后转化大肠杆菌，长出很多菌，用M13F和M13R引物做菌落PCR，基本上50个菌里只有一个菌的条带是3Kb,剩下的49个菌大多为1Kb以下的片段。Blunt载体不会自连，那长出的那么多杂菌到底是为什么？而且菌落PCR长度为3Kb的菌送去测序，测序结果显示也是错的，发生单碱基的缺失突变或者替换突变。 如果是连接不成功的话，为什么会长菌，而且用M13F和M13R引物做菌落PCR大多有条带，只是条带长度不到3Kb。 将菌落PCR条带长度为3Kb的菌送去测序，得到的测序结果都发生突变 ，突变集中在一个区段，但是每次突变的具体位点不同。另外还有一个3Kb的基因甚至连接后，长出特别多的菌，但是没有菌落PCR条带为3Kb的，更换过连接温度和连接比例都没有效果，做了好多板，就是没有长度为3Kb的条带 。到底是哪里出现了问题呢？
2 个回答
土井挞克树
考虑是引物的问题，引物不匹配可能性大，更换一款引物后重连。
loveliufudan
以下是一些可能导致问题的原因：
1. DNA质量和纯度：首先要确保使用的DNA样品质量良好且纯度高。低质量或污染的DNA样品可能会干扰连接反应，并引入错误的突变。
2. 酶消化：连接过程中，需要对目标片段和载体进行限制性内切酶消化。确保酶消化条件正确，时间充分，并且没有潜在的限制性酶位点冲突。
3. 连接反应条件和比例：按照Blunt-Zero Cloning Kit的建议使用正确的反应条件和比例进行连接反应。确保连接体系中的各个组分的比例正确，且反应时间和温度适当。
4. 转化效率和选择性：大肠杆菌的转化效率和选择性也可能对结果产生影响。确保使用高效的化学转化方法或电穿孔转化，并使用正确的选择性培养基来筛选正常连接的菌落。
5. 菌落PCR条件：确保使用适当的PCR条件和引物浓度进行菌落PCR。检查引物的特异性和扩增条件，以确保准确扩增目标片段。
6. DNA测序：如果测序结果显示突变，可能是由于连接过程中发生错误，或在PCR扩增或测序过程中引入了突变。确保测序反应的质量良好，并进行双向测序以验证结果。
7. 可能的其他问题：此外，还有一些其他可能的问题，如反应体系中的污染、非特异性扩增或错误的引物设计等，可能导致连接失败或异常结果。
