转化过程目的基因TA克隆出现的问题讨论

我的目的基因是TA克隆后做的切胶胶回收，当时用的载体pMD18-T分子量在2692bp，我的目的基因条带长度在2750bp左右，双酶切后条带很接近，听导师意见我又用了Hind-Ⅲ做了单酶切，跑出来的条带还是很接近，一直跑到底部才做的切胶胶回收

然后再与pet42a连接，前段时间做转化，长出来大概24个菌落，我把所有的都做了菌落PCR，结果还不错，阳性率挺高。我把后续的 阳性的全做了双酶切，但是结果很奇怪，基本都以三个条带为主，1-5是重组质粒（未酶切）的条带，6-10是对应双酶切后的条带

当时以为最短的那个条带是pMD18-T的长片段（双酶切后大概在2217bp——2546bp之间），后来把目的基因的胶回收产物进行了验证，发现并不是

（因为我考虑的是目的基因切胶的时候把pMD18-T的长片段切进来了，然后在胶回收结束中和双酶切后的目的基因连接，在转入过程中和pet42a连接，转化成功组仍能在含卡那霉素抗性的平板里生长，在后续的菌液PCR能看到目的基因，双酶切后按碱基对从高到低能看到pet42a长片段（5000bp左右）、目的基因（2750bp左右）、pMD18-T长片段（2217bp-2546bp之间）三个条带，可以找连接前（即切胶胶回收后剩下的进行电泳），若猜想正确，则在5000bp值左右会出现单一条带）

现在也不知道是什么原因，求求大家帮帮找找原因吧5555，谢谢大家啦