原理
将集落在瓷制克隆环、玻璃环、PTFE 环或者不锈钢环中用胰蛋由酶消化后移至24 孔或12 孔板中的一个孔或者直接种于 25 cm2 的培养瓶内。
材料与仪器
胰蛋白酶
硅油
克隆培养环 巴氏吸管 生长培养基 多孔板 无菌镊 移液器 粗头笔
硅油
克隆培养环 巴氏吸管 生长培养基 多孔板 无菌镊 移液器 粗头笔
步骤
1. 观察细胞克隆，用毡制粗头笔或 Nikon 标记笔（毡制粗头笔或者最好用 Nikon 标记笔或物镜标记笔，可插入显微镜物镜换镜转盘的位置，对所选的克隆集落划上标记）在培养皿底面对要分离的集落做标记。
2. 撤去培养基，用 D-PBS 轻轻冲洗细胞克隆。
3. 用无菌镊夹取一个克隆培养环（放在培养皿中干热或高温高压灭菌），蘸取硅油（于玻璃培养皿中160°C 干热灭菌 1 h , 或121°C 高压灭菌 15 min），硅油面朝下，压放在培养皿上，使硅油均匀分布在克隆培养环底面。
4. 将环圈套于所需集落上。
5. 在同一培养皿重复步骤 4、5 , 圈套 2~3 个其他所需集落。
6. 加足量的 0.25 % 胰蛋白酶（D-PBS 配制的 0. 25 % 胰蛋白酶）充满环内（0.1~0. 4 ml，取决于环内径的大小）。
7. 保留 20s，后弃去。
8. 盖上培养皿，37°C 下孵育 15 min 。
9. 每个环中加 0.1~0. 4 ml 的培养基。
10. 依次对每个克隆用吸管吹吸分散细胞，并将细胞悬液分别移入 24 孔板的一孔或竖直放置的 25 cm2 的培养瓶内，每个细胞克隆都分别使用独自的吸管或枪头（黄色枪头或弯头吸管和带钝头的巴氏吸管）。
11. 再用 0.1~0.4 ml 的培养基冲洗克隆环，再将这些培养基分别移入相应的培养孔或培养瓶中。
12. 将培养孔中的培养基加至 1 ml，盖好，继续培养。如果用的是培养瓶，就在每个瓶中加 1 ml 的培养基，竖直放置培养。
13. 当克隆细胞长满培养孔时，移至 25 cm2 培养瓶内，加 5 ml 培养基，常规培养。如果采用的是直立培养瓶法，当瓶底长满细胞后，撤去培养基，胰蛋白酶消化，加 5 ml 培养基，平放培养瓶继续培养。
2. 撤去培养基，用 D-PBS 轻轻冲洗细胞克隆。
3. 用无菌镊夹取一个克隆培养环（放在培养皿中干热或高温高压灭菌），蘸取硅油（于玻璃培养皿中160°C 干热灭菌 1 h , 或121°C 高压灭菌 15 min），硅油面朝下，压放在培养皿上，使硅油均匀分布在克隆培养环底面。
4. 将环圈套于所需集落上。
5. 在同一培养皿重复步骤 4、5 , 圈套 2~3 个其他所需集落。
6. 加足量的 0.25 % 胰蛋白酶（D-PBS 配制的 0. 25 % 胰蛋白酶）充满环内（0.1~0. 4 ml，取决于环内径的大小）。
7. 保留 20s，后弃去。
8. 盖上培养皿，37°C 下孵育 15 min 。
9. 每个环中加 0.1~0. 4 ml 的培养基。
10. 依次对每个克隆用吸管吹吸分散细胞，并将细胞悬液分别移入 24 孔板的一孔或竖直放置的 25 cm2 的培养瓶内，每个细胞克隆都分别使用独自的吸管或枪头（黄色枪头或弯头吸管和带钝头的巴氏吸管）。
11. 再用 0.1~0.4 ml 的培养基冲洗克隆环，再将这些培养基分别移入相应的培养孔或培养瓶中。
12. 将培养孔中的培养基加至 1 ml，盖好，继续培养。如果用的是培养瓶，就在每个瓶中加 1 ml 的培养基，竖直放置培养。
13. 当克隆细胞长满培养孔时，移至 25 cm2 培养瓶内，加 5 ml 培养基，常规培养。如果采用的是直立培养瓶法，当瓶底长满细胞后，撤去培养基，胰蛋白酶消化，加 5 ml 培养基，平放培养瓶继续培养。
注意事项
培养皿暴露过长时间会变干， 所以要限制分离的克隆数量或在每步操作之间盖上培养皿。
来源：丁香实验
