TA克隆常见问题分析及其解决方案

问  题

可能的原因

建      议

转化后无克隆菌产生

转化过程有问题或感受态细胞失活

可通过转化pUC18/19等未切割的可用于抗性筛选的质粒，检测感受态细胞的转化效率和转化操作是否正确

插入对照DNA片段的阳性率低

10×快速连接缓冲

液稀释不当

提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度，10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液

连接反应存在问题

连接缓冲液只有低的活性。10×快速连接缓冲液含有ATP，温度波动ATP 易降解。使用一次性分装的缓冲液，避免其反复冻化

通过凝胶比较连接的和未连接的DNA 片段并检查分子量标准DNA 片段是否被连接成高分子量的片段，用大约20ng DNA 分子量标准（如Lambda DNA/Hind III 分子量标准）建立一个连接反应以检测连接酶及缓冲液的活力

T 突出端丢失，引起载体平端连接，因而蓝色菌落数高于白色菌落数

避免核酸外切酶的引入，降解T 突出端。只使用无外源核酸酶的T4 连接酶

插入克隆片段与插入对照DNA相比，白色菌落的比例低。

如果使用的感受态细胞的转化效率很高（ ≥1 × 109 cfu/µg DNA），则是连接反应存在问题

如果使用1×10⁹ cfu/µg DNA 的感受态细胞，用试剂盒中的阳性对照进行连接实验， 白色菌落的比例应为70－90％。如连接反应没有优化或失败，虽然转化的总克隆菌数很高（≥1×10⁹ cfu/µg DNA 感受态细胞可获得高至300 个菌落），但白色菌落很少或没有。参见以上“连接反应存在问题”中的建议对策

采用插入对照DNA片段，连接转化时白色克隆菌数低于60％。

10×快速连接缓冲液稀释不当

提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度，10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液

T 突出端丢失，引起载体平端连接，因而蓝色菌落数高于白色菌落数。

避免核酸外切酶的引入，降解T 突出端。只使用系统自己提供的T4 连接酶，这种连接酶外切酶活力最低

连接温度太高

连接温度过高（>28℃）可使背景增加，使重组克隆菌减少。降低连接温度可以提高白斑率

PCR 产物连接时白色菌落数很少或根本没有。

10×快速连接缓冲液稀释不当

提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度，10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液

连接孵育时间不够长

连接过夜可得到理想结果

PCR 产物中含有抑制连接的成分，导致连接的失败

将PCR 产物和连接反应对照混合，观察是否存在抑制效应。如怀疑有抑制成分存在，应重新纯化PCR 产物

PCR 产物没有3’-A 突出端，不能连接。

并非所有DNA 聚合酶都产生3’-A 突出端，如Pfu酶的PCR产物为平端。平端PCR产物可先通过聚合酶及dATP 进行加尾反应产生3’-A 突出端，再与T载体连接

由于紫外灯过度照射形成嘧啶二聚体，PCR 产物不能连接。

PCR 产物已经插入，但未破坏lacZ 基因的翻译框。

插入片段：载体连接比例不理想。

连接的PCR 片段中可能有引物二聚体

PCR 反应扩增的多种产物克隆到pGM-T Easy或pBS-T载体中。

DNA 重排

检测大量克隆观察重排是否是随机的。如果是随机重排，通过筛选可得到有目的DNA 片段的克隆菌，而如果所有克隆是一种重排方式，则需要使用修补缺陷的菌株保护插入片段，减少重排事件的发生

PCR 连接反应只产生白色克隆（没有蓝色克隆）

氨苄失活，因而氨苄敏感菌可生长。

检查氨苄平板是正常制备并在一个月内使用

菌株（如TOP10）丧失F’因子

检测背景对照，如果菌落不是蓝色的，则可能是宿主菌细胞丢失F’因子（假设acIqZ.M15 位于宿主菌的F’因子上，并使用正常平板）。用于T-载体系统的感受态细胞一定要正确制备

平板不适合蓝白斑筛选。

检测背景对照，如果克隆菌不是蓝色的，检查平板是否含有氨苄/IPTG/X-Gal 以及是否新鲜。如平板有问题，重新制备新鲜平板

含有目的PCR产物的克隆菌数不够。

PCR 片段很多没有A 尾。

将PCR 产物纯化后进行加尾反应。样品纯化后进行连接反应

插入片段：载体比例不理想。

凝胶电泳检测PCR 产物的完整性及产量，优化插入片段

多个PCR 产物被克隆进pGM-T 或pBS-T 载体

凝胶纯化目的PCR 产物