【求助】求助检测细胞凋亡的最佳方法

实验需要检测细胞凋亡，请问：
1 共聚焦激光扫描显微镜是否可以用来做细胞凋亡的形态学检测？敏感性如何？这个方法好吗？磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）是否可以用共聚焦激光扫描显微镜来观察结果，其结果有相应的处理软件可以分析吗？
2 用于检测细胞凋亡的最佳方法是哪种？

麻烦做细胞凋亡的高手指导一下，谢谢！

FCM

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一、形态学观察方法
1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
二、DNA凝胶电泳
（一）、检测原理
细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
（二）结果判断
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定
凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
（一）检测步骤
1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；
2、在微定量板上吸附组蛋白体’
3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘
4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’
4、加酶的底物，测光吸收制。
（二）用途
该法敏感性高，可检测undefined100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。
四、流式细胞仪定量分析
检测原理
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

个人认为如果要选最佳方法还应针对你的试验材料、目的、条件来选择。